崔 淼,朱春江,刘向荣
(长春中医药大学，吉林 长春130017)
糖尿病是最常见的慢性疾病之一，是由遗传因素和环境因素共同作用引起的以持续性的高血糖以及长期代谢紊乱为主要表现的代谢综合征。我国18岁及以上成年人糖尿病的患病率为12.8%，预计到2045年世界范围内糖尿病的患病人数将达到7亿，而死于糖尿病或是其并发症的约有420万人[1]，全球每年因糖尿病的相关医疗支出约为7600亿美元[2]，给全球经济带来了巨大的负担。糖尿病动物模型的构建，可以较好的模拟糖尿病的发生发展过程，有利于对糖尿病的病理改变及发病机制的观察、治疗药物的筛选[3]。本文主要对糖尿病动物模型构建的相关文献进行综述，为以构建糖尿病模型为基础的研究提供参考。
自发性糖尿病动物模型指的是在自然条件下，因为先天性或遗传性因素而发生糖尿病表现的动物。
1.1 1型糖尿病动物模型
1.1.1BB大鼠 BB(Bio-Breeding)大鼠是自发性1型糖尿病动物模型，是由加拿大渥太华生物培养实验室培养而来的远交系的动物模型，大鼠淋巴细胞中的CD8+与CD4+T细胞会自发性减少，故该型大鼠会因胰岛素缺乏引起的酮血症而导致死亡[4]，与人类1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus T1DM)的表现相似，可以作为T1DM在遗传、免疫学等方面研究的动物模型。
1.1.2NOD小鼠 NOD小鼠 (non-obese diabetic mouse)是1974年日本大阪的实验室用JCR-ICR品系的糖尿病小鼠杂交而来的1型糖尿病动物模型。该模型的小鼠因免疫细胞激活而导致胰岛β细胞被袭击破坏，进而呈现出糖尿病的临床表现。不注射胰岛素时，NOD小鼠仅可存活数周，但不会因酮血症死亡，这是此种模型不同于人类1型糖尿病的情况[5]。而NOD小鼠中的MHC2类的结构与人类中的MHC2类相似，会使此种动物模型的小鼠与人类对糖尿病具有相同的抵抗力或是易感性，使NOD小鼠在糖尿病遗传机制的研究中有重要作用[6]。
1.2 2型糖尿病动物模型
1.2.1GK大鼠 GK(Goto-Kakizaki)大鼠指的是Goto等在1975年，在白化的Wistar大鼠中挑选并培养的，是自发性和非肥胖2型糖尿病动物模型[7]。它的特点主要是胰岛分泌能力低，血糖有轻度升高，其血糖升高的主要原因是胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷[8]，与人类2型糖尿病的发病机制相类似。但模型的建模时间较长且难度大，同时成活率不高，应用于研究时会受到一定限制。
1.2.2OLETF大鼠[9]OLFETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)大鼠是自发性2型糖尿病动物模型，是日本制药公司在1984年通过杂交得到的动物模型。该模型的大鼠在早期的主要表现是胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱，晚期则可合并糖尿病肾病，与人类的2型糖尿病很相似。该模型大鼠因其胆囊收缩素A型受体(cholecystokinin type A receptor,CCKAR)的基因表达完全缺失，故大鼠常有肥胖的表现，同时，OLETF大鼠X染色体上的ODB1基因、14号染色体上的ODB2基因以及睾酮，均与2型糖尿病发病有着密切相关[10]，因此成为对糖尿病治疗药物作用机制进行研究时常用的动物模型。
1.2.3Zucker大鼠 Zucker兄弟于1961年在Zucker大鼠体内发现了“肥胖基因”fa，Zucker大鼠是2型糖尿病动物实验中常用的肥胖大鼠模型。Zucker大鼠因基因突变，出现肥胖且伴有高胰岛素血症、高脂血症以及中度高血压，血糖呈轻度升高，是研究糖尿病血管病变的理想动物模型[11]。
1.2.4KK-Ay小鼠 KK小鼠是具有和人的肥胖性糖尿病相似特征的动物模型，是K.Kondo在1941年应用Kasukabe小鼠原种群培育得来的具有先天性遗传缺陷性小鼠。因KK小鼠没有显著的表型特征，研究者将突变毛色基因(ay)转入小鼠体内，形成KK-Ay小鼠。ay基因可以影响小鼠的毛发，更重要的是其可以引发代谢紊乱，导致小鼠出明显的肥胖和高血糖等表现，而雄性小鼠的表现更为明显，此种动物模型广泛用于T2DM的实验模型[12]。
1.2.5ob/ob小鼠、db/db小鼠 ob/ob (obese)小鼠和db/db(diabetes)小鼠都是属于遗传性肥胖2型糖尿病的动物模型，其中ob基因和db基因属于常染色体隐性基因，两种动物模型的小鼠均有严重的肥胖、多食多尿，以及高血糖等表现[13]。ob/ob小鼠的leptin(ob基因产物)缺乏，导致胰岛素抵抗恶性循环的产生，db/db小鼠是因4号染色体上的瘦素蛋白受体(Lepr)基因发生突变，导致出现Lepr沉默和高胰岛素血症[14]。此两种小鼠有助于对2型糖尿病血脂紊乱的研究及对抗糖尿病药物的筛选。
2.1 手术诱导糖尿病动物模型
手术诱导糖尿病动物模型的方法，最早的是胰腺切除法。Minkowshi在1889年应用手术方式切除了狗的胰腺，术后狗出现多饮、多食、多尿及尿糖等糖尿病的表现，第一次成功构建了糖尿病动物模型。切除猪的胰腺后，猪的葡萄糖耐量低于正常水平，构建了糖尿病动物模型。胰腺切除术诱导的糖尿病动物模型较为稳定，但因胰腺的切除，导致胰岛素绝对缺乏，动物可能会出现高血糖、酮症酸中毒等表现，甚至动物出现死亡[4]，与此同时，手术切除进行造模过程繁琐，术中可能损伤其他组织[15]，术后有感染等风险。
2.2 饮食诱导糖尿病动物模型
饮食诱导法一般是用高脂高糖的饲料连续喂养实验动物，其发生的机制可能是该种饮食引发动物体内糖脂代谢紊乱，从而降低胰岛素敏感性，导致出现胰岛素抵抗[4]。通过给小鼠持续喂食1-20周的高脂(含有5%-60%脂肪)饮食构建糖尿病动物模型，喂食的时间主要取决于研究需要的模型病变严重程度。研究表明[16]，不同品种的小鼠对高脂饮食喂养的反应是存在差异的，同品种小鼠在面对高脂饮食喂养的反应也存在一定不同，即在表型上有一定差异性。在糖尿病动物模型构建过程中，需要密切监测其食物的摄入量以及体重的变化情况。除此之外，高脂饮食诱导糖尿病动物模型的构建，也受到实验动物性别的影响。高雪等[17]研究结果表明，通过延长大鼠高脂饲料的喂养时间，能够加重其糖尿病的肾脏损害。同时，此种方法可以作为糖尿病脑病动物模型的诱导方法[18]，广泛用于对糖尿病并发症的相关研究。
2.3 药物诱导糖尿病动物模型
2.3.1链脲佐菌素(streptoxolocin，STZ)诱导法
STZ是一种能够使胰岛β细胞产生毒素的抗菌素，1963年首次发现其有引发糖尿病的作用，其作用机制主要是致胰腺β细胞损伤，引起胰岛素分泌减少，从而出现糖尿病症状[19]。1976年KOLB等研究，首次发现通过静脉或腹腔注射STZ可以诱导出糖尿病动物模型。另有研究表明，胰岛的损伤程度与STZ的剂量大小呈现明显的正相关，一方面大剂量注射STZ可使大量胰岛β细胞破坏，血糖迅速升高，建模的成功率高，另一方面迅速升高的血糖易导致动物酮症酸中毒而死亡[20]。冷昌龙等[21]分别选择150 mg/kg和50 mg/kg两种不同剂量的STZ，进行单次大剂量及多次连续小剂量的腹腔注射，用以构建糖尿病动物模型，结果显示小剂量多次的STZ注射，会使动物的血糖水平升高缓慢，但呈现持续上升，并维持在较高的水平。研究显示[22]，雄性动物的糖尿病动物模型成模率高于雌性动物，且糖尿病动物模型中糖的代谢紊乱程度，亦是雄性大鼠高于雌性大鼠，故在糖尿病动物模型中雄性大鼠会较早出现死亡。
2.3.2四氧嘧啶(alloxan，ALX)诱导法
四氧嘧啶是一种胰岛β细胞毒剂，会产生超氧自由基破坏胰岛β细胞，导致胰岛素缺乏，进而导致血糖过高及糖尿病的发生，此方法常用于构建1型糖尿病模型。腹腔内给药170 mg/kg和200 mg/kg的ALX，两个剂量构建糖尿病动物模型的成功率均在90%以上，但其死亡率不同，170 mg/kg的给药量死亡率较低[24]。该药物诱发糖尿病的机理与STZ相似，但四氧嘧啶所引起高血糖症具有不稳定性及可逆性，故此种方法构建的糖尿病动物模型不能恰当的对降糖药的作用进行评估[23]。
2.4 饮食诱导联合STZ诱导法
高糖高脂饮食能降低动物对胰岛素的敏感性，进而诱发胰岛素抵抗[25]，在此基础上注射小剂量STZ，能够破坏部分的胰岛β细胞，导致胰岛素的分泌相对不足，使其更接近2型糖尿病模型[26]。应用此种建模方法，高糖高脂饮食的喂养时间及STZ的注射剂量的不同，会对建模产生不同的影响。Mansor等[27]的研究结果显示，高脂喂养实验动物2周后联合25 mg/kg的STZ腹腔注射，可以构建2型糖尿病动物模型，但该模型稳定性较差，仅维持了1周。刘丹丹等[28]应用高脂饮食喂养6周联合30 mg/kg的STZ腹腔注射，此种方法模型构建成功率为70%，且模型的稳定性有所提高，维持了2周。另有研究表明[29]，高脂饲料喂养大鼠6-8周，然后进行小剂量的STZ腹腔注射，2型糖尿病的建模成功率为79%。STZ的注射剂量会受高糖高脂饮食喂养时间的影响，给予动物高脂饮食喂养的时间越长，诱发动物的胰岛素抵抗越明显，STZ的注射剂量也就相对的减少[30]。而STZ的给药途径也会影响建模所需的STZ的剂量，黎娅等[31]的研究表明，高脂饮食喂养12周联合25 mg/kg的STZ进行尾静脉的注射，能够成功构建2型糖尿病模型，且模型的血糖水平稳定，构建成功率较高。此种建模方法可以作为糖尿病脑病等糖尿病并发症的构建[18]，广泛适用于对2型糖尿病的并发症及药物研究。
基因工程动物模型指的是借助基因工程技术人为控制动物的基因表达，使动物获得相应的遗传特性，基因工程技术主要包括基因打靶技术、转基因技术等，此技术构建的糖尿病动物模型的科学性较强，但是技术比较复杂。研究表明[32]，应用Cre/loxP DNA结合技术敲除GLUT2基因，可以构建糖尿病动物模型。应用胚胎干细胞(ES)打靶技术[33]能够成功构建2型糖尿病动物模型。应用ES打靶技术敲除GCK基因上C57BL6J位点后的小鼠，其后代的小鼠的空腹血糖水平有显著的增加[34]。应用ES打靶技术敲除了TCF7L2基因的小鼠，在给予高脂饮食喂养后，小鼠的胰岛素敏感性受损，胰岛素分泌减少[35]。IRS-1基因缺失纯合子(IRS-1-/-) 的小鼠在成年后，小鼠出现胰岛素抵抗、糖尿病等表现的大约在半数左右[30]。应用ZFNs技术，利用胚胎显微镜敲除NOD小鼠的TNFRSF9基因，能够成功构建2型糖尿病动物模型[36]。应用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以成功获得基因修饰的糖尿病动物模型[37]。应用CRISPR/Cas9技术敲除鼠的瘦素受体基因，小鼠会出现体重增加、高血糖等糖尿病的症状[38-39]。
综上所述，糖尿病动物模型的构建是研究糖尿病发病机制基础，是研究糖尿病治疗药物的关键环节。本文对常用的构建糖尿病动物模型方法进行分析总结，每种构建方法都具有各自的优势及相应的局限性。自发性糖尿病动物模型短期内在糖尿病症状及血糖变化等方面表现不突出；
实验性糖尿病动物模型因多应用化学药物诱导，其动物模型的建模成功率较低，而死亡率相对较高；
基因工程技术的糖尿病动物模型，在构建上需要的时间较长，并且对构建模型的设备要求较高。实验性糖尿病动物模型在目前实验中应用较多，但在研究过程中，应根据具体的研究目的及实际的实验条件等情况选择合适的建模方式。在了解各种建模方式的原理基础上，根据研究需要将各种建模技术进行适宜的组合，以提高建模的效率。
