李 悦，周 川，梁 鹏，梁芸丹
成都医学院基础医学院 病理学与病理生理学教研室（成都 610500）
抑郁症是一种复杂和严重的精神疾病，以观念、情绪、运动和植物神经症状受损等为特点，可导致患者严重残疾[1]。目前抑郁症已成为全球致残的主要原因之一[2]。世界卫生组织报道，全球约有3.22亿人受其影响，且约有7.5 %的患者会导致残疾[3]。目前，抑郁症的发病机制仍未明确，但抑郁症相关的基因多态性研究[4]表明，抑郁症具有遗传性，总体遗传率为31%～41%，此种程度的遗传特性使其难以找到风险或保护位点；
其次可能由于抑郁症的显著异质性和多样化，未找到有意义的基因位点[5]。同时抑郁症在全球的发病率高，世界不同地区的不同基因存在差异，这进一步扩大了寻找抑郁症风险或保护性位点的难度，因此与抑郁症有关的基因多态性研究范围广泛。原钙黏蛋白（PCDHs）是钙黏蛋白超家族中最大的家族，大多在神经系统中表达，在神经突触的连接和作为受体在信号传导过程中发挥一定作用[6]。PCDHs主要分为簇状PCDHs（cPCDHs） 和非簇状PCDHs （ncPCDHs），聚集形成的cPCDHs参与神经元的形成和存活，与自闭症谱系障碍、精神分裂症、女性局限性癫痫和认知障碍等的神经、精神疾病有关[7]。编码原钙黏蛋白9（PCDH9）基因的缺乏会减少积极情绪行为，可能是抑郁症新的风险因素[8-9]。有研究[10-12]显示，PCDH9的表达与神经形成、物体识别和感觉运动发育等有关，可调节神经回路的形成。由此推测，PCDH9可能是抑郁症的一个新的生物标志物或一个潜在的治疗位点。
本研究通过分析PCDH9单核苷酸多态性rs9540720与抑郁症的相关性，探讨PCDH9单核苷酸多态性rs9540720在抑郁症发生和发展中的作用。
1.1 临床资料
收集2018年3月至2019年12月3家医院480例抑郁症患者作为试验组，329例非抑郁症患者作为对照组，所有样本均来源于中国汉族人。该研究经成都医学院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。患者诊断标准依据疾病和有关健康问题的国际统计分类第十次修订本，症状的严重程度评分采用汉密尔顿抑郁评定的24项版本。使用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管收集所有受试者2～3 mL外周静脉血全血样品，并储存在-20 ℃冰箱中。排除标准：神经系统疾病、急性或慢性感染、甲状腺功能异常、神经生殖系统疾病（如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症）及其他疾病，如物质滥用共病、认知障碍、参与评估能力差等；
目前怀孕或喂养。临床数据来自医疗记录，包括年龄、性别、发病年龄、汉密顿抑郁量表（hamilton depression scale，HAMD）评分、脉搏率、抑郁程度、家族史、自杀观念/行为及是否首发。
对照组男 105例，女 224例，年龄（44.00 ± 16.90）岁。试验组男 139例，女 341例，年龄（41.80±17.60）岁；
发病年龄（36.80±16.90）岁；
心率（80.60±11.40）次/min；
中度抑郁228例，重度抑郁252例；
有家族病史94例，无家族病史386例；
有自杀观念292例，无自杀观念188例；
首次发病248例。
1.2 主要试剂
血液基因组DNA快速抽提试剂盒、AMPure XP磁珠、琼脂糖胶、引物、通用P7引物、通用P5引物、PCR Ready Mix均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。
1.3 主要仪器
Qubit 2.0荧光定量仪[赛默飞世尔（中国）有限公司]、PCR仪（BIO-RAD，T100TM）、电 泳 仪（BIO-Rad，powerPac Basic）、HiSeqXTen测序仪（Illumina，San Diego，CA）。
1.4 方法
1.4.1 基因DNA提取 使用血液基因组DNA快速抽提试剂盒对血液样品进行DNA抽提，并在提取完成后使用Qubit 2.0对获得的DNA进行浓度测定，确保获得高质量基因组DNA。
1.4.2 基因分型 以上述方法提取出的DNA为模板，以 上 游 引 物“AGAGAAAGTTTCTTTTTGAGACC AG” 和 下 游 引 物“ACAAAAAGTAACATTTTCT TTTCTT”扩增出含有rs9540720位点的DNA片段。多重扩增条件：98 ℃预变性 3 min，[98 ℃（30 s）、50 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）]进行8个循环，[98 ℃（30 s）、66 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）]进行 25个循环，72 ℃延伸5 min，产物通过AMPure XP磁珠纯化回收，并进行二轮扩增获得Illumina测序文库，扩增条件如下：98 ℃预变性 5 min，[94 ℃（30 s）、55 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）]进行5个循环，72 ℃延伸5 min，使用AMPure XP磁珠纯化回收，PCR产物分别等量混合，再使用HiSeqXTen测序仪进行测序，对PCDH9家族rs9540720进行分型。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析，直接计数获得rs9540720基因型频率，采用χ2检验分析rs9540720基因型在两组中的分布情况和Hardy-Weinberg平衡，采用比值比（OR）和95%置信区间（Cl）评估基因多态性和病情情况的相关性，并根据年龄和性别数据对OR值进行校正。检验水准α除特别说明外均设定为0.05。
PCDH9基因rs9540720多态位点在两组共显性、显性、隐性、等位基因方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。通过对试验组抑郁发作程度、自杀观念/行为和是否为首发患者的分层分析发现，中度抑郁症患者中AG和AG-AA基因型频率分别为57.02%和74.56%，高于重度抑郁症患者中的频率（46.43%和62.30%），差异有统计学意义（AG与GG相比：OR=1.81，95%CI：1.08～3.03，P＜ 0.05；
AG-AA与GG相比：OR=1.75，95 %CI：1.00～3.06，P ＜ 0.05）（表 2）。
表1 PCDH9基因rs9540720多态性与抑郁症的关联[n（%）]
表2 PCDH9基因rs9540720在抑郁症患者中的分层分析[n（%）]
抑郁症是一种复杂、常见的疾病，其发作和发展涉及许多因素[13]。新型冠状病毒肺炎疫情的流行加剧了抑郁症的患病率以及社会负担[14]，因此关于抑郁症的研究尤为重要。越来越多研究[15-16]表明，抑郁症的发病机制可能与患者个体遗传异常有关，或与出生前不明的基因突变有关。PCDH9基因的缺乏会减少积极情绪行为，有必要进一步研究编码PCDH9基因在抑郁症中的作用。
本研究结果显示，PCDH9基因SNPrs9540720多态性与自杀观念/行为、是否为首次发病无关，表明抑郁症患者的自杀观念/行为、是否首次发病与该基因无关，可能是由其他基因或因素决定。抑郁症的病因尚未明确，但目前多数学者[17-18]认为是基因-环境因素共同发挥作用所致。因此未来研究应对有自杀倾向或首次发病的抑郁症患者进行多因素分析。通过对抑郁症危险因素的认识，加强对自杀风险和抑郁症首次发病的早期识别，并尽早进行预防干预，同时提高治愈率。
本研究发现，PCDH9基因 rs9540720多态性可能与抑郁症的严重程度有关，AG和AG-AA基因型携带者更易发生中度抑郁症，表明PCDH9基因rs9540720多态性与抑郁症发病机制可能有关。目前，PCDH家族有较多成员已被研究[19-22]证明与精神类疾病有关，如PCDH19基因多态性可能与癫痫有关，PCDH8可能与自闭谱系有关，PCDH10、PCDH17等与神经、精神疾病有关。有研究[11]表明，PCDH9参与长期社会和物体识别及感觉运动发展，PCDH9缺陷导致特定的长期社会和物体识别障碍。有研究[23]表明，PCDHs主要在大脑中表达，并受发育调节，与其他PCDH家族成员一样，PCDH9主要在胎儿和成人的大脑中表达，其在大脑中发育调节的表达模式表明，这些蛋白直接影响形态发生的各个方面。同时在抑郁症的研究中，进行社交交流训练可有效缓解抑郁症的负面情绪，促进社会功能恢复[24]。以上研究结果表明，PCDH9基因rs9540720多态性与抑郁症发病机制有关，这或许可以解释在分层分析中的阳性结果。
本研究存在一定局限性。首先，本研究样本量较小，未来有必要扩大样本量对抑郁症发病机制进行进一步研究；
其次，本研究样本纳入标准较简单，采用的是使用最低限度表型定义的患者，该结果可能是由抑郁症遗传和非遗传风险因素的异质性和多基因性质以及抑郁症亚型的异质性共同决定[25]。此外，尽管本研究有相关证据表明基因对疾病易感性的贡献，但缺乏实质性的分子遗传学发现[26]，无法进一步证实抑郁症风险多态性对mRNA表达的影响。因此，有必要在此基础上进行细胞表达实验以及动物实验，同时继续收集临床样本进行进一步的研究。
综上所述，本研究结果显示PCDH9基因rs9540720位点可能与抑郁症严重程度有关，可能是抑郁症病情的风险因子。在后续研究中有必要扩大候选基因选择范围，进一步揭示PCDH9基因在抑郁症发病机制中的作用。
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