谢硕崟，翟昌林，王海波
(1浙江中医药大学·浙江 杭州 310053；
2嘉兴市第一医院·浙江 嘉兴 314001)
近年来，随着我国经济水平提升，人民膳食结构发生了改变，并且伴随人口老龄化程度的加重，各类心血管疾病的发病率和致死率持续增长[1]。心血管疾病的发生与心肌细胞凋亡具有密切的联系，其中细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)是导致细胞氧化应激损伤的主导因子[2],冠心病无论是慢性稳定型心绞痛或是心肌梗死以及冠脉开通过程中的缺血再灌注损伤均会导致心肌细胞产生大量的ROS[3]；
因此，探究发现抑制心肌细胞凋亡及氧化应激损伤的特异性药物一直是临床研究的重点。桑黄，味苦，性寒，归肝、肾经，《本草纲目》记载其能“利五脏，宣肠胃气，排毒气”，被列为“上药”。桑黄素，又名桑色素，类黄酮类物质，是桑黄中的主要有效成分之一，既往研究表明桑黄素具有抑制内皮细胞炎症反应、降血脂等作用[4-6]。本研究观察了桑黄素对于心肌过氧化损伤的保护作用及其与凋亡相关通路的相关性，现报道如下。
1.1 实验材料 桑黄素：MACKLIN公司，货号：C13876704；
桑黄素溶液的配制：使用分析天平称取桑黄素4.0 mg，加入500 μL DMSO溶液，彻底溶解后加入4.5 mL完全培养基，使用0.22 μm孔径的过滤器过滤除菌，母液浓度为2.5 mmol/L，根据前期预实验结果，选择加入细胞中的终浓度为25 μmol/L。H9C2心肌细胞：上海中乔新舟生物科技有限公司。低糖DMEM培养基：Hyclone公司；
胎牛血清：Gibco公司；
CCK8试剂盒：Elabscience公司，货号：E-CK-A362；
ROS试剂盒：南京建成公司，货号：E004-1-1；
Western blot抗体：Affinity公司，Bax(货号：AF0120)、Bcl-2(货号：AF6139)、Caspase-3(货号：AF6311)、β-actin(货号：AF7018)；
H2O2：环凯微生物，批号：6108124。ELX800酶标仪：BIOTEK公司；
LSR Fortessa流式细胞仪：美国BD；
TZD-CL-200S显影仪：厦门天中达生物科技；
CKX41显微镜：奥林巴斯。
1.2 细胞培养 H9C2心肌细胞培养于37 ℃，含5%的二氧化碳培养箱中，使用低糖DMEM培养基添加10%的FBS，细胞生长至80%予以传代。
1.3 细胞分组 H9C2心肌细胞传代铺板后分为3组。正常组(control组)：正常培养及同步换液处理；
氧化损伤组(ODG组)：待实验细胞生长密度达到70%时，加入H2O2,浓度设定为600 μmol/L,持续作用12 h；
桑黄素组(Morin组)：在构建氧化损伤模型前，加入桑黄素25 μmol/L，持续作用12 h。
1.4 CCK8实验 (1)消化对数生长期的H9C2心肌细胞，铺96孔板，每孔铺6 000个细胞，培养24 h；
(2)3组细胞分别处理：其中正常组予以换液处理，氧化损伤组构建氧化损伤模型，桑黄素组使用桑黄素25 μmol/L预处理12 h后构建氧化损伤模型；
(3)向每孔加入10 μL CCK8溶液；
(4)使用酶标仪设定450 nm检测波长，测定各组吸光度值；
(5)计算细胞活力值。细胞活力值=(实验组OD值-空白孔OD值)/(正常组OD值-空白孔OD值)×100%。
1.5 流式细胞仪检测心肌细胞ROS表达 细胞接种于6孔板，不同组别细胞经过相应处理后，将DCFH-DA(10 μmol/L)加入到6孔板中，37 ℃孵育30 min，PBS清洗细胞3次，导入流式细胞仪进行细胞内测定ROS表达。
1.6 Western blot检测各组心肌细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达 PBS润洗3组细胞，放置于冰上，加入RIPA裂解液提蛋白，BCA法测蛋白浓度，调整浓度一致后以1∶2的比例加入3×loading buffer,95 ℃变性5 min，制分离胶和浓缩胶，进行蛋白电泳、转膜，5%脱脂牛奶室温摇床上封闭2 h，PBS润洗后4 ℃摇床上孵育一抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)，孵育时长12 h，PBS润洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，PBS润洗后ECL化学显影，QuantityOne软件计算各组条带灰度值。
1.7 统计学方法 应用SPSS24.0统计软件进行统计分析，计量资料首先予以正态性检验，符合正态分布的数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。
2.1 各组心肌细胞活性比较 见表1。
表1 各组心肌细胞活力值比较
2.2 各组心肌细胞内ROS表达量的比较 通过流式细胞仪检测各组心肌细胞内ROS表达，与正常组相比，氧化损伤组与桑黄素组ROS表达量均明显上升(均P<0.05)，与氧化损伤组相比，桑黄素预处理后，细胞内ROS表达量明显降低(P<0.05)。见图1。
2.3 各组心肌细胞凋亡相关蛋白表达的Western blot检测结果 通过Western blot比较各组凋亡相关蛋白的表达，相较于正常组，氧化损伤组与桑黄素组促凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax的表达量均明显上升(均P<0.05)，与氧化损伤组相比，桑黄素预处理后，Caspase-3、Bax的表达量明显降低(均P<0.05)，抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达量明显上升(P<0.05);与此同时，氧化损伤组相较于正常对照组，抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达量明显下降(P<0.05)，桑黄素组相较于正常组，Bcl-2表达量的比较无统计学意义(P<0.05)。见图2。
注：与正常对照组比较，*P<0.05；
与氧化损伤组比较，#P<0.05图1 各组心肌细胞内ROS流式细胞检测及荧光强度比较
注：与正常对照组比较，*P<0.05；
与氧化损伤组比较，#P<0.05图2 各组心肌细胞凋亡相关信号通路蛋白表达的Western blot检测结果比较
桑黄素属于天然的五羟基黄酮的一种，广泛分布于自然界之中，可提取自桑橙树、黄桑木等桑科植物或多种中草药[7]，同时也普遍存在于海藻、番石榴叶、洋葱等植物中[8]。关于桑的用药最早记载于《神农本草经》，之后的本草中也均有收录[7]。目前多种研究证实桑黄素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激等多种活性[9-11]。基于黄酮类化合物多数具备抗氧化作用的特性，本研究重点从抗氧化应激及凋亡的角度探索了桑黄素对于心肌过氧化损伤的保护作用。
桑黄素通过抗氧化应激对多种器官发挥保护作用的研究已经得到了广泛验证[9,12]，Pragna等[13]构建高糖诱导的鼠神经损伤模型，发现桑黄素可调节Nrf2-NF通路平衡发挥保护作用，Lee等[14]发现桑黄素可抑制过氧化氢酶活化从而抑制仓鼠成纤维细胞的氧化损伤，Khalid S. AlNumair等[15-16]通过异丙肾上腺素构建了大鼠心梗模型，通过桑黄素预处理发现具有心肌细胞的保护作用，但缺乏机制方面的探索。本研究基于以上研究构建了大鼠H9C2心肌细胞的过氧化氢氧化损伤模型，发现桑黄素预处理可有效减轻心肌细胞的氧化损伤及凋亡，并进一步探讨了各组心肌细胞内ROS的表达及凋亡相关通路蛋白的表达。
相关研究显示：心肌损伤过程中会导致ROS爆发，ROS的表达过量会引起线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)大量开放，并且该过程不可逆[17],持续的缺血缺氧、氧化性损伤、钙离子超载、磷酸盐浓度增高均会导致线粒体去极化加重，导致MPTP一直处于开放状态，导致分子量大于1.5 kd的物质轻易进入线粒体内膜，引起ATP耗竭、线粒体肿胀、离子平衡失调、最终心肌细胞致死[18-19]。MPTP开放的过程中Bcl-2家族蛋白也发挥了调控作用[20]，Bax作为促凋亡蛋白可与VDAC或ANT结合从而加剧MPTP的开放，而Bcl-2具有竞争性结合ANT的作用发挥抗凋亡作用[21]，同时，Bcl-2的表达提升具有抑制ROS生成的作用，阻断下游Caspase级联凋亡的活化，进一步发挥凋亡抑制作用[22]。本研究同时测定了Bax与Bcl-2的表达，结果发现桑黄素预处理在心肌过氧化损伤过程中可有效降低Bax的表达、提升Bcl-2的表达。
综合上述，桑黄素可能通过调控凋亡相关通路抑制MPTP开放发挥对双氧水致心肌细胞氧化损伤的保护作用。
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