李智宁，李飞飞，宋梦娇，马艳妮，张丽先，张桃桃，魏 悦*
1河南省科学院天然产物创新研究中心；
2河南省纳普生物技术有限公司；
3河南省植物天然产物开发工程技术研究中心，郑州 450000；
4河南中医药大学药学院，郑州 450046
汉麻，又名工业大麻(CannabissativaL.)，为大麻科(Cannabaceae)大麻属(CannabisL.)一年生草本植物，又名火麻、云麻等，是指植物中四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)含量低于0.3%的非毒品性大麻类型[1,2]。大麻是我国的传统经济作物也是历史悠久的药用植物[3]，其种子(火麻仁)、茎秆以及花叶具有不同的实际应用价值[4]。最新基于基因组重测序的研究显示，大麻最早起源于东亚，之后按照纤维型大麻(工业大麻)和毒品型大麻两种模式经过强烈的人工驯化形成了现今形态各异的大麻品种[5]。我国有20多个省市都有工业大麻种植历史，其中大面积种植工业大麻的地区有黑龙江和云南省，甘肃、吉林等地也有零星种植[6]，其应用涉及医药、食品、保健品和化妆品等多个领域[7]。现代药理研究表明，大麻具有镇痛、降眼压、抗肿瘤、抗呕吐、抗紫外、抗菌、抗炎等功能活性[8,9]。近年来，大麻非精神活性类成分大麻二酚(cannabidiol，CBD)的作用机制和新药研发取得了突破性进展，基于CBD的各种大麻新产品开发成为了国际热点，而我国在该领域的研究几乎空白[10]。此外，大麻精油作为大麻植株体内一种挥发性成分也含有较强的活性因子。例如，石竹烯可用于治疗慢性支气管炎和关节炎、α-蒎烯可用于治疗黑色素瘤，亚油酸乙酯可用于降低血脂改善动脉粥样硬化，红没药醇可以用于保护、治疗皮肤过敏等[11]。国外已有研究应用于日化领域，形成了护手霜，浴液，面霜等产品，由于其政策敏感性，国内相关开发和利用研究很少。
植物精油提取方法主要有固相微萃取法[12]、同时蒸馏萃取法[13]、微波辅助萃取法[14]、超临界流体萃取法和亚临界流体萃取法等[15-21]，如Tian等[22]采用微波辅助-水蒸气蒸馏法和超临界CO2萃取法提取汉麻叶精油，共鉴定出90种化合物，多为烃类、醇类等小分子挥发物，且其采用顶空萃取进样，操作繁琐，易造成重现性差等问题，鉴定出的种类也不齐全，不能全面反映精油全组分。因此，本研究分别采用水蒸馏提取法(以下简称水蒸馏法)、亚临界以及超临界萃取法三种方法来获得汉麻茎叶精油，系统全面地比较三种方法获得的精油全组分及其各组分间含量的差异性和特征性，以期发现更多潜在活性成分为汉麻产业合理、合规的开发利用提供科学依据，也为后期进行汉麻精油的活性测试和批量提取选择一个高效便捷的提取方式，为汉麻精油(组分)产品开发及其抗氧化、抗炎等活性筛选提供研究基础，具有理论和指导意义。
1.1 原料
挑选完整、无虫病害的汉麻植株(云南昆明)作为试验原料，汉麻茎叶原料从产地直接收集，经河南省科学院赵天增研究员鉴定，均为大麻科Cannabaceae大麻属CannabisLinn.汉麻CannabissalivaL.植株的茎叶，标本存放于河南省科学院天然产物重点实验室(编号zwyn20180017)。
1.2 仪器与试剂
GCMS-2010Uira 型气相色谱-质谱仪(日本岛津公司)；
超临界萃取装置、亚临界萃取装置、LPG-5型喷雾干燥器(常州市一新机械厂)；
HSCE40-24X2型大提取装置(上海研究机械设备有限公司)；
KQ-5WE超声池(昆山市超声仪器有限公司)；
ME204型万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；
甲醇(LC/MS级，Fisher Scientific公司)；
水为娃哈哈矿泉水，乙醇等其他试剂均为分析纯。
1.3 色谱条件
色谱柱：Rxi-5ms(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；
柱流量：1.16 mL/min；
流量控制方式：线速度；
压力：78.1 kPa；
进样量：1 μL；
进样口温度：280 ℃；
柱温80 ℃(保持1 min)，以5 ℃/min升到220 ℃(保持2 min)，5 ℃/min升到320 ℃(保持5 min)，分流比50∶1。
1.4 质谱条件
离子源EI，Scan扫描模式；
离子源温度200 ℃；
接口温度250 ℃；
电子能力70 eV；
检测器电压0.93 kV；
溶剂延迟3.0 min。扫描范围35～500 amu；
经GC-MS分析得到不同提取方式下汉麻精油的总离子流色谱图(total ion chromatogram，TIC)(见图1～3)。
图1 水蒸馏方法提取汉麻精油的总离子流色谱图Fig.1 TIC of hemp essential oil extracted by water distillation method
图2 亚临界方法提取汉麻精油的总离子流色谱图Fig.2 TIC of hemp essential oil extracted by subcritical method
图3 超临界方法提取汉麻精油的总离子流色谱图Fig.3 TIC of hemp essential oil extracted by supercritical method
1.5 样本前处理
将汉麻茎叶原料置于干燥阴凉的地方阴干，使用粉碎机粉碎并通过二号筛(24目)，得到汉麻茎叶粗粉，将过筛的样品放于密封袋中，放置在4 ℃的冰箱中备用。
1.5.1 水蒸馏法
称取处理好的汉麻茎叶粗粉约75.00 g(准确至0.01 g)，将粗粉置于1 000 mL圆底烧瓶中，再按照料液比1∶10将水加入到圆底烧瓶中，混合搅拌均匀，在50 ℃下平衡0.5 h，50 ℃温浴2 h，采用水蒸气蒸馏法收集馏出的挥发油，根据《中国药典》2020版四部通则附录挥发油测定法(2204)进行提取[24]，保持微沸大约3～5 h左右，当精油提取器中的精油量不再增加时停止加热，放置片刻，读取汉麻精油的提取含量并分离出精油，重复提取3次，计算物料中汉麻精油的收率平均值。
汉麻茎叶精油得率 (mL/g)=
汉麻茎叶精油体积 (mL)/汉麻茎叶粗粉质量 (g)
1.5.2 亚临界法
称取约50.00 g(准确至0.01 g)汉麻茎叶粗粉放置于亚临界萃取装置中，使用丁烷为夹带剂，萃取温度40 ℃，萃取压强为0.45 MPa，萃取时间为20 min，萃取3次。萃取液从萃取罐进入分离罐，减压脱除溶剂，得到粗提物，在搅拌下向浸膏中加入10 倍量的95%乙醇，加热至50 ℃，保持40 min使其充分溶解，待溶液冷却至室温后，转移至-20 ℃冰箱中冷冻过夜，抽滤后，在0.01 MPa、浴温35 ℃条件下将滤液浓缩至无溶剂，得到汉麻茎叶精油样品，并计算供试品中精油的收率[15,16]。精油得率计算公式同“1.5.1”。
1.5.3 超临界法
称取约50.00 g(准确至0.01 g)的汉麻茎叶粗粉添加到萃取釜，密封安装后进行超临界CO2萃取，萃取压力为29 MPa，萃取温度49 ℃，萃取时间4 h，CO2流量为13 mL/min，最后记录所提取得到的精油含量，并计算供试品中汉麻茎叶精油的收率[25]。精油得率计算公式同“1.5.1”。
1.5.4 供试品溶液的制备
准确称取上述方法制备获得的精油约100 mg放于10 mL的离心管中，加入5 mL甲醇(或正己烷)超声提取溶解，并定容，再将配置好的溶液稀释50倍，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1 三种方法制备汉麻茎叶精油的比较
采用3种方法制备得到的汉麻茎叶精油的得率、性状及鉴定化合物数如表1所示。结果表明，三种方法提取的汉麻茎叶精油得率差异明显。亚临界法和超临界法比水蒸馏法的得率提高了50%以上，得到的精油颜色稍深；
超临界萃取法提取的精油得率最高，采用乙醇作夹带剂，溶解出汉麻茎叶中的色素成分，因此精油颜色较深，显现出绿黄色油状，浓缩除去精油中的乙醇，最终精油得率为0.0031 mL/g。从鉴定化合物数进行比较，水蒸馏法提取得到的成分最多，高达89个，而亚临界和超临界两种方法获得的成分比较接近，且有高达40个共有成分，所得指纹图谱也很相近。
表1 三种方法制备的汉麻茎叶精油的比较Table 1 Comparison of essential oils from stems and leaves of hemp prepared by three methods
2.2 汉麻精油成分GC-MS分析
将所得的精油全组分的质谱图与分析软件中的美国国家科学技术研究所的NIST质谱库2011版和2014版(NIST-2011、NIST-2014)进行检索比对并结合文献查阅分析，对各个成分峰的化合物的相似度进行评价分析，采用峰面积归一化法计算出各组分的相对含量，结果见表2。结果表明，水蒸馏法共提取出89种成分，亚临界萃取法共提取出62种成分，超临界萃取法共提取出59种成分，三者共计含有13种共有成分。水蒸馏法所提取得到的成分最多，且主成分在种类和含量上也有较大差异。其中，水蒸馏法提取的成分中主要有：大麻二酚(19.69%)、α-红没药醇(9.07%)、石竹烯及其衍生物(8.87%)、植物醇(8.54%)、次大麻二酚(7.05%)、抗氧剂168(4.01%)、Δ9-四氢大麻酚(4.00%)、大麻酚(3.04%)、大根香叶酮(2.80%)、大麻色原烯(2.78%)、大麻环酚(2.51%)、大根香叶三烯醇(2.41%)、邻苯二甲酸二丁酯(2.02%)、β-愈创木烯(1.78%)、植酮(1.51%)等成分，同时还含有大量的低挥发性小分子化合物；
亚临界法提取的成分主要有：邻苯二甲酸二正辛酯(17.56%)、亚油酸甲酯(8.66%)、二十二烷基多沙酸8,11,14-三烯酸酯(7.94%)、大麻二酚(7.86%)、亚油酸(6.51%)、(Z)-9-十六碳烯醛(6.41%)、Δ9-四氢大麻酚(5.90%)、γ-谷甾醇(5.24%)、棕榈酸(3.61%)、甘油(3.51%)、(+)-柠檬烯(2.35%)、植物醇(2.42%)、棕榈酸甲酯(1.86%)、大麻色原烯(1.79%)、大麻酚(1.84%)等成分；
超临界法提取的成分主要有：油酸(22.50%)、大麻二酚(8.71%)、亚油酸(7.68%)、γ-谷甾醇(6.71%)、Δ9-四氢大麻酚(6.62%)、(+)-柠檬烯(4.17%)、棕榈酸(4.05%)、油酸乙酯(2.92%)、邻苯二甲酸二正辛酯(2.89%)、大麻酚(2.09%)、大麻色原烯(1.80%)、亚油酸甲酯(1.40%)、胆固醇(1.38%)、亚油酸缩水甘油酯(1.36%)、棕榈酸甲酯(1.34%)、甘油(1.32%)、Δ9-四氢大麻素(1.16%)等成分。
表2 不同提取方法下汉麻精油成分鉴定和比较分析Table 2 Component identification and comparative analysis of hemp essential oil under three different extraction methods
续表2(Continued Tab.2)
续表2(Continued Tab.2)
续表2(Continued Tab.2)
续表2(Continued Tab.2)
续表2(Continued Tab.2)
亚临界萃取法和超临界萃取法所得到的成分在种类上有着很大的相似性，且多为半挥发性成分或大分子化合物，经统计发现二者共有40个共有成分。其中甘油，棕榈酸甲酯，棕榈酸，亚油酸，Δ9-四氢大麻素，大麻二酚、大麻色原烯，大麻酚、Δ9-四氢大麻酚、γ-谷甾醇、坎培甾醇等在含量上比较接近。然而，亚临界法所获得的(+)-柠檬烯、油酸乙酯、油酸缩水甘油酯、棕榈油酸等成分含量低至超临界法的2-5倍左右，但却远高于水蒸馏法所得，而亚油酸甲酯成分含量远高于超临界法和水蒸馏法。同样，水蒸馏法所得的α-红没药醇，植物醇，植酮，次大麻二酚，大麻二酚等明显高于亚临界法和超临界法。此外，亚临界法获得了较高含量的邻苯二甲酸二正辛酯和二十二烷基多沙酸8,11,14-三烯酸酯两种酯类成分，占比高达25.5%，而超临界法获得了较高含量的油酸，占比22.5%，同时，二者提取获得的高分子化合物或半挥发性成分明显多于水蒸馏法所得，但小分子化合物或低沸点的成分却损失严重。这可能是基质所处的提取环境，提取条件，夹带剂的使用不同等原因使得所提取的精油成分与溶剂分子间作用力不同而造成。
本试验经过大量试验优化和筛选，获得3种方法下汉麻精油的GC-MS总离子流色谱图，使得各成分间实现较好的分离，提高了鉴定的准确度、可信度。通过对3种不同提取方法所获得的汉麻精油全组分进行GC-MS鉴定分析和比较研究，结果发现：三种方法所得精油共计鉴定出154个成分，且含有13个共有成分，相似度均在80%以上，其中水蒸馏法获得提取成分最多，高达89种，多为烷烃、烯烃、醇类、醛类、倍半萜类等小分子化合物成分，而超临界和亚临界萃取法所得精油组分在具有一定的相似性，多为酸类，醇类，酯类，酚类等高沸点化合物或大分子化合物，且含有40个共有峰，但含量差异明显，如植物醇，亚油酸，油酸，大麻二酚等。
虽然水蒸馏法获得的提取成分种类比较多，但是出油率较低，并且挥发性成分或主成分含量也与另外两种提取方法有着较大的差异。这是因为水蒸气蒸馏时，热水中能溶解一定比例的精油(挥发油)成分，水蒸气蒸馏时蒸馏温度能达到100 ℃，所以，沸点较高的成分不容易被蒸出，同时，不同成分在热水中溶解度不同，各成分被蒸出的比例也不尽相同。水蒸馏法主要将那些低沸点、小分子化合物成分等提取出来，因此，使用水蒸馏法可以获得较多种类的挥发性成分。而亚临界和超临界两种提取方法在提取原理和获得成分上具有一定的相似性，二者提取时在适宜的临界温度和压强下可使得极性较大的化合物，高沸点化合物或大分子化合物分离出来，同时伴随着夹带剂的使用，夹带剂与溶质分子间存在范德华力或夹带剂与溶质具有特定的分子间作用，如氢键及其他各种作用力，这样不仅改善和维持了萃取的选择性，而且还提高了难挥发性溶质和极性溶质的溶解度，相比水蒸馏法可以分离萃取出更多中性成分或半挥发性成分，同时也会造成一些小分子成分的损失。综合考虑，亚临界萃取法作为一种新型萃取手段，具有低温高保活、常压易实现、环境友好型优点，最大限度地保留了热敏性，易挥发性，易水解，易氧化组分，同时还具有节能、成本低等优点，可考虑将亚临界萃取法作为提取汉麻精油的理想方法。
汉麻精油是汉麻植株体内的一种挥发性次生代谢产物，其中的一些组分具有独特的药用和食用价值，鉴于其本身具有较强的挥发性，渗透性，芳香性，不仅可以调节情绪，还可以抗虫，抗菌等，具有较高的应用前景。因此，本试验可为后期进行汉麻精油的活性测试和批量提取选择一种高效便捷的提取方式提供试验依据，为进一步定性定量研究汉麻精油(组分)及其功能活性价值提供数据和参考，也为深入挖掘汉麻应用潜力以增强汉麻产业发展后进提供科学指导。
猜你喜欢汉麻大麻超临界超临界LNG在螺旋形微通道中的流动传热特性舰船科学技术(2022年10期)2022-06-17黑龙江省汉麻产业现状与发展对策*南方农机(2021年20期)2021-12-25工业大麻中大麻二酚的研究进展中成药(2021年5期)2021-07-21大麻二酚在医学上的应用前景昆明医科大学学报(2021年2期)2021-03-29我国汉麻高附加值产品受青睐农村百事通(2019年23期)2019-12-30350MW超临界CFB锅炉BT、MFT保护回路设计及回路优化电子制作(2019年20期)2019-12-04汉麻亟待全产业链协同发展纺织服装周刊(2019年38期)2019-12-01科技在线儿童故事画报·发现号趣味百科(2017年1期)2017-06-01大麻是个啥？华声(2016年20期)2016-11-191200MW等级超超临界机组可行性研究电力建设(2015年2期)2015-07-12
