徐月亮， 王孝彬， 杨尧庆
(空军军医大学唐都医院胸外科， 陕西 西安 710032)
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌、肺鳞癌和肺腺癌为其主要病理类型，与非小细胞肺癌、肺腺癌相比，肺鳞癌的发病机制与治疗策略研究明显滞后，严重威胁着人们的生命健康[1]。目前肺鳞癌的治疗手段主要有手术、放化疗、免疫治疗和靶向治疗等，但是患者晚期预后较差，化疗易产生耐药性，治疗效果并不理想[2]。因此，深入探究肺鳞癌发生发展的机制至关重要。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)参与并调控包括癌症在内的多种疾病的发生发展[3,4]。有研究证实，LINC00342在非小细胞肺癌组织和细胞中高表达，可促进癌细胞转移[5]，而miR-384在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达水平降低[6]。通过生物信息学分析发现，LINC00342与miR-384可靶向结合。然而，LINC00342对人肺鳞癌细胞恶性生物学行为的影响尚不明确。因此，本研究主要探究LINC00342对肺鳞癌细胞恶性生物学行为的影响及潜在机制。
1.1细胞：人肺鳞癌细胞系SK-MES-1购自中科院上海细胞库。
1.2主要试剂：CCK-8试剂盒(CK04)购自上海经科化学公司；
Transwell小室(货号：3413)购自北京信生元生物医学科技有限公司；
兔源一抗基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)(ab97779)、MMP-9(ab142180)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(ab265585)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)(ab4051)均购自英国Abcam公司；
LipofectamineTM 2000 Reagent(ab136465)购自美国Invitrogen公司；
LINC00342敲低质粒(si-LINC00342)及对照(si-NC)，miR-384抑制剂(miR-384 inhibitor)及对照(inhibitor-NC)、miR-384模拟物(miR-384 mimic)及对照(mimic-NC)、LINC00342及miR-384引物购自广州RiboBio公司。
1.3方 法
1.3.1细胞培养：将SK-MES-1细胞置于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM高糖培养基中，在37℃、5% CO2环境下常规培养，每3d更换一次培养基，当细胞融合度达到85%以上时，消化传代，收集对数期的细胞进行实验。
1.3.2细胞转染：将对数期的SK-MES-1细胞分为ctrl组(正常培养的SK-MES-1细胞)、si-NC组(转染si-NC)、si-LINC00342组(转染si-LINC00342)、si-LINC00342+inhibitor-NC组(si-LINC00342和inhibitor-NC共转染)、si-LINC00342+ miR-384 inhibitor组(si-LINC00342和 miR-384 inhibitor共转染)。转染严格按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent操作步骤进行。
1.3.3RT-qPCR法检测LINC00342、miR-384表达：使用Trizol提取各组细胞中的总RNA，将RNA逆转录为cDNA后，以cDNA为模板上RT-qPCR仪进行扩增。LINC00342：正向引物，5"-CGTTCCAATGTGTTGGGT-3"，反向引物，5"-TGGGAGGAGGTTGAGATG-3"；
miR-384：正向引物，5"-ATTCCTAGAAATTGTTCATA-3"；
反向引物，5"-GAACATGTCTGCGTATCTC-3"；
GAPDH：正向引物，5"-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3"，反向引物，5"-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3"；
U6：正向引物，5"-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3"；
反向引物，5"-GAGGTATTCGCAGAGGA-3"。分别以GAPDH、U6为内参，采用2-ΔΔCT计算细胞中LINC00342、miR-384的相对表达量。
1.3.4CCK-8法检测细胞增殖：各组细胞接种到96孔板中，每孔初始接种约1×104个细胞，培养24、48、72h后，弃去细胞上清液，且在指定的时间点向每个孔中加入含有10μL CCK-8溶液的100μL完全培养基。孵育2h后，使用酶标仪检测吸光度。
1.3.5Transwell实验检测细胞侵袭：将基质胶包被在上室，并向上室加入无血清的SK-MES-1细胞重悬液100μL，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。在37℃、5% CO2下孵育24h后，取出Transwell小室，弃去孔中的培养基，擦去上部未侵袭的细胞，PBS洗涤，甲醇固定，0.1%结晶紫染色。在光学显微镜下计数。
1.3.6划痕实验检测细胞迁移：取各组细胞，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h后，采用20μL移液器枪头进行划痕，显微镜下记0h细胞的划痕宽度为W0，记24h时细胞的划痕宽度为W24。划痕愈合率(%)=(W0-W24)/W0×100%。
1.3.7流式细胞仪检测细胞凋亡：收集各组SK-MES-1细胞，PBS洗涤，重悬细胞，再分别添加Annexin V-FITC和PI染液5μL，充分混匀，于室温下避光染色15min，使用BD流式细胞仪快速检测细胞凋亡情况。
1.3.8Western blot检测蛋白表达：利用RIPA裂解缓冲液提取SK-MES-1细胞总蛋白。电泳分离后，100V恒压转移蛋白至PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶封闭2h，将膜与一抗PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3、GAPDH，在4℃孵育过夜，再将膜与HRP偶联的羊抗兔二抗在室温下孵育2h，弃去液体，洗涤3次，加入ECL试剂观察蛋白质印迹，Image J软件评估各组细胞蛋白相对表达水平。
1.3.9双荧光素酶报告基因实验：构建LINC00342野生型质粒(LINC00342-WT)和突变型质粒(LINC00342-MUT)，将LINC00342-WT和LINC00342-MUT分别与mimic-NC或miR-384 mimic共转染于SK-MES-1细胞，48h后，检测荧光素酶活性。
2.1各组SK-MES-1细胞中LINC00342、miR-384表达比较：与ctrl组、si-NC组比较，si-LINC00342组SK-MES-1细胞中miR-384表达升高，LINC00342表达降低(P<0.05)；
与si-LINC00342组、si-LINC00342+inhibitor-NC组比较，si-LINC00342+ miR-384 inhibitor组SK-MES-1细胞中LINC00342表达变化差异无统计学意义(P>0.05)，miR-384表达降低(P<0.05)，见表1。
表1 各组SK-MES-1细胞中LINC00342 miR-384表达比较
2.2各组SK-MES-1细胞增殖能力比较：与ctrl组、si-NC组比较，si-LINC00342组SK-MES-1细胞OD450值降低(P<0.05)；
与si-LINC00342组、si-LINC00342+inhibitor-NC组比较，si-LINC00342+ miR-384 inhibitor组SK-MES-1细胞OD450值升高(P<0.05)，见表2。
表2 各组SK-MES-1细胞OD450值比较
2.3各组SK-MES-1细胞侵袭情况比较：与ctrl组、si-NC组比较，si-LINC00342组SK-MES-1细胞侵袭数目减少(P<0.05)；
与si-LINC00342组、si-LINC00342+inhibitor-NC组比较，si-LINC00342+miR-384 inhibitor组SK-MES-1细胞侵袭数目增多(P<0.05)，见图1和表3。
图1 各组SK-MES-1细胞侵袭情况比较(×400)
表3 各组SK-MES-1细胞侵袭数目比较
2.4各组SK-MES-1细胞迁移能力比较：与ctrl组、si-NC组比较，si-LINC00342组SK-MES-1细胞划痕愈合率降低(P<0.05)；
与si-LINC00342组、si-LINC00342+inhibitor-NC组比较，si-LINC00342+miR-384 inhibitor组SK-MES-1细胞划痕愈合率升高(P<0.05)，见图2和表4。
图2 划痕实验检测SK-MES-1细胞迁移
表4 各组SK-MES-1细胞划痕愈合率比较
2.5各组HN-3细胞凋亡情况比较：与ctrl组、si-NC组比较，si-LINC00342组SK-MES-1细胞凋亡率升高(P<0.05)；
与si-LINC00342组、si-LINC00342+inhibitor-NC组比较，si-LINC00342+miR-384 inhibitor组SK-MES-1细胞凋亡率降低(P<0.05)，见图3和表5。
图3 各组SK-MES-1细胞凋亡情况比较
表5 各组SK-MES-1细胞凋亡率比较
2.6各组SK-MES-1细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表达比较：与ctrl组、si-NC组比较，si-LINC00342组SK-MES-1细胞PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低，caspase-3表达升高(P<0.05)；
与si-LINC00342组、si-LINC00342+inhibitor-NC组比较，si-LINC00342+miR-384 inhibitor组SK-MES-1细胞PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高，caspase-3表达降低(P<0.05)，见图4和表6。
表6 各组SK-MES-1细胞中PCNA MMP-2 MMP-9 caspase-3蛋白表达比较
图4 Western blot检测SK-MES-1细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表达注：A：ctrl组，B：si-NC组，C：si-LINC00342组，D：si-LINC00342+inhibitor-NC组，E：si-LINC00342+miR-384 inhibitor组
2.7双荧光素酶报告基因检测结果：查询Starbase数据库可知LINC00342与miR-384之间有结合位点，见图5。与mimic-NC和LINC00342-WT共转染组比较，miR-384 mimic和LINC00342-WT共转染组荧光素酶活性降低(P<0.05)；
与LINC00342-MUT和mimic-NC共转染组比较，LINC00342-MUT和miR-384 mimic共转染组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)，见表7。
图5 LINC00342与miR-384的结合位点
表7 荧光素酶活性比较
LncRNA可调节癌症的许多重要病理过程，如肿瘤发生、增殖、转移，在肺鳞癌的机制研究中有着重要地位[7,8]。LINC00342的异常表达在多种癌症中充当致癌基因，例如，LINC00342表达在胃癌组织和细胞系中上调[9]；
在结肠腺癌中，LINC00342的高表达与患者预后不良有关，敲低LINC00342可抑制结肠腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡[10]。此外，有研究表示，LINC00342在非小细胞肺癌中呈高表达，敲低其表达可抑制非小细胞肺癌细胞增殖[11]。而LINC00342对肺鳞癌的影响尚不清楚，因此，本研究设计转染si-LINC00342到SK-MES-1细胞中，检测其对肺鳞癌细胞的影响。研究结果显示，敲低LINC00342可降低SK-MES-1细胞的OD450值、侵袭数目、划痕愈合率、PCNA、MMP-2和MMP-9表达，升高了细胞凋亡率、caspase-3表达，提示敲低LINC00342可阻止SK-MES-1细胞的恶性生物学行为，促进细胞凋亡。
LncRNA通过靶向miRNA对癌症发挥调控作用，例如，LncRNA UNC5B-AS1可充当miR-339-5p的分子海绵，敲低其表达可通过靶向上调miR-339-5p抑制人肺腺癌A549细胞增殖，促进其凋亡[12]。LINC00342过表达可通过抑制miR-15b表达，促进肺腺癌转移[13]。miR-384已被确定为多种癌症中与癌症相关的新型miRNA。有研究证实，miR-384在非小细胞肺癌中呈低表达，上调其表达可诱导非小细胞肺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖[14]。本研究发现LINC00342与miR-384存在调控关系，通过si-LINC00342与miR-384 inhibitor共转染于SK-MES-1细胞探究其对肺鳞癌的影响。结果显示，抑制miR-384表达减弱了敲低LINC00342对SK-MES-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的抑制作用，降低了促细胞凋亡作用。提示敲低LINC00342可能通过上调miR-384抑制SK-MES-1细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡。
综上所述，敲低LINC00342可能通过靶向miR-384，抑制肺鳞癌细胞SK-MES-1增殖、侵袭和迁移。LINC00342/miR-384可能成为治疗肺鳞癌的一种新的靶点。然而本研究尚存在不足之处，仅仅在细胞水平上验证了LINC00342/miR-384对SK-MES-1细胞增殖、侵袭和迁移的影响，并未在体内水平上进行探讨，后续研究将会在体内水平上进行进一步探索。
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