罗梦花，陈佩文，陈志红，吴民华，龚先玲*（. 广东医科大学药学院，广东 东莞 53808；
. 广东医科大学基础医学院，广东 东莞 53808）
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一。化疗是肿瘤的治疗方式之一，虽然在临床上出现了许多抗肿瘤的化疗药物，并且配合放疗可以使患者的病情有所好转，延长了寿命，但这些化疗药物常常会导致人体出现各种不良反应和毒副作用，从而使肿瘤患者在治疗过程中产生其他疾病或损伤。中草药具有使用历史悠久，毒副作用相对较小，效果较好等优势，因此从中草药中开发新的防治肿瘤的天然药物是研究方向之一。5F是岭南草药半边旗中的一种二萜类成分，全称为11β-hydroxy-15-oxo-16-ent-kaur-16-en-19-oic acid或 ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid[1]，具有抗炎、抑制多种肿瘤细胞增殖等作用[2-5]。但关于5F对结直肠癌的影响报道很少。本研究探讨二萜化合物5F对结直肠癌细胞凋亡及自噬的影响，并初步探究其抗肿瘤作用的机制。
1.1 试药
5F（HPLC纯度≥98%；
广东医科大学天然药物研究与开发重点实验室自制）[4]。二甲基亚砜（DMSO）、MTT（法国MP公司）；
Hoechst 33342（Beyotime公司）；
z-VAD-fmk（R&D systems公司）；
吖啶橙（AO）、氯喹（CQ）（美国Sigma公司）。人结直肠癌细胞SW480、HCT116（中国科学院上海细胞库）。RPMI 1640培养液、胎牛血清（美国Gibco公司）；
青-链霉素混合液（北京Solarbio科技有限公司）；
蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司）；
Anti-Pro-Caspase-3、Cleaved Caspase-3、PARP、Bax、Bcl-2、LC3A/B抗体（美国Cell Signalling Technology公司）；
β-actin（北京中杉金桥公司）；
辣根过氧化物（HRP）标记山羊抗兔、HRP标记山羊抗鼠二抗（武汉Boster 公司）；
ECL 化学发光试剂盒（美国Millipore公司）。
1.2 仪器
Nikon Ti-S型倒置荧光显微镜（日本Nikon公司），Thermo Scientific Multiskan Sky全波长酶标仪（美国Thermo公司），化学发光成像仪MiniChemi Ⅱ（北京赛智创业科技有限公司）。
2.1 细胞培养
人结直肠癌细胞SW480、HCT116生长在含1% 青-链霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。在倒置显微镜下观察，细胞呈单层贴壁状态生长，细胞生长状态良好。每2日细胞传代一次。
2.2 MTT法测定5F对结直肠癌细胞生长活力的影响
分别取对数生长期的SW480、HCT116细胞，弃上清液，PBS漂洗2次，用0.25%的胰酶消化，完全培养液中和胰酶，离心，弃上清液，将细胞密度调整成8×104个·mL-1。并以每孔100 µL接种在96孔板中，培养过夜，待细胞贴壁后，每孔加100 µL 5F溶液，使药物的终浓度分别为0（空白组）、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1，每个处理设5个重复。培养24、48 h后每孔加5 g·L-1MTT 20 μL，反应 4 h，吸出上清液，加200 μL DMSO，振荡溶解甲瓒结晶，用酶标仪在490 nm 处测OD值。
2.3 Hoechst 33342染色
将细胞密度为8×104个·mL-1的SW480、HCT116细胞分别接种于6孔板中，培养过夜待细胞贴壁后，加入0（空白组）、25、50、100 μmol·L-1的5F溶液，培养48 h，吸出旧培养液，PBS洗2次，加Hoechst 33342后于37℃孵育15 min，PBS漂洗2次，然后用倒置荧光显微镜观察细胞形态。
2.4 Western blot检测相关蛋白的表达水平
5F分别处理SW480、HCT116细胞相应时间后，弃去旧液，收集细胞，加RIPA裂解液裂解，并于4℃、12 000 r·min-1离心25 min，取上清液，得总蛋白。采用BCA法检测各组总蛋白含量。每组蛋白分别加一定量的上样缓冲液并混合均匀，在沸水浴中变性5 min。各组取等量蛋白经SDSPAGE电泳，分离结束后，用转膜仪转移至PVDF膜上，然后将PVDF膜放入5% 脱脂奶粉中封闭1 h。加一抗Anti-Pro-Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2、LC3A/B（1∶1000），4℃孵育过夜。用稀释10 000倍的HRP酶标记的二抗，室温孵育 60 min，吸出二抗，TBST洗涤3次，每次5 min。在避光条件下，混合化学发光液A和B，再在膜上滴加混合均匀的化学发光试剂，然后将膜置于化学发光成像仪的暗室中曝光，拍照并分析相关蛋白表达的变化。
2.5 AO染色检测细胞内酸性细胞器
将细胞密度为8×104个·mL-1的SW480、HCT116细胞分别接种于12孔板中，培养过夜，待细胞贴壁后，加入不同浓度的5F溶液，培养24 h，吸出旧液，PBS洗1遍，4%多聚甲醛室温固定15 min，每孔加入1 μg·mL-1的 AO工作液，室温避光孵育15 min，去除AO工作液，PBS 洗2次，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。
2.6 统计学分析
采用SPSS 22.0软件统计分析数据，实验数据用均值±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；
两两比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
3.1 二萜化合物5F对结直肠癌细胞生长的影响
图1为MTT 法检测不同浓度5F对SW480、HCT116细胞活力的影响。5F分别作用结直肠癌细胞24 h、48 h后，随着药物浓度增加，细胞存活率均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。同一浓度下，随着5F作用时间增加，细胞活力也降低。
图1 5F对人结直肠癌SW480、HCT116细胞活力的影响Fig 1 Effect of 5F on cell viability of SW480 and HCT116 cells
3.2 倒置荧光显微镜观察5F对结直肠癌细胞形态的影响
图2为倒置荧光显微镜观察5F对结直肠癌细胞SW480、HCT116形态的影响。倒置显微镜下，空白组细胞贴壁正常生长；
不同浓度5F分别处理结直肠癌细胞48 h，随着5F浓度增加，SW480和HCT116细胞的形态变圆，密度变小。Hoechst 33342染色，空白组细胞的细胞核呈正常均匀的蓝色荧光；
5F作用SW480和HCT116细胞后出现细胞核固缩现象，细胞核呈现明显的亮蓝色荧光，且随着5F浓度的增加，呈现明显亮蓝色荧光的细胞核数目也增加。
图2 5F对SW480、HCT116细胞形态学的影响（×200）Fig 2 Effect of 5F on morphology of SW480 and HCT116 cells（×200）
3.3 5F处理结直肠癌细胞后凋亡相关蛋白的表达
Hoechst 33342染色显示5F处理结直肠癌细胞后表现出凋亡的特征，细胞死亡是否由凋亡引起，还需进一步证明。因此本研究用 Western blot检测了与凋亡相关的蛋白表达，结果见图3。不同浓度的5F分别处理SW480、HCT116细胞24 h，随着5F 浓度的增大，Pro-Caspase-3蛋白的表达呈下调趋势，而Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白的表达逐渐增加；
与空白组比较，Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP 表达显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。说明5F有诱导SW480、HCT116细胞凋亡的作用。
图3 5F对SW480、HCT116细胞相关凋亡蛋白的影响Fig 3 Effect of 5F on apoptosis-related proteins in SW480 and HCT116 cells
3.4 5F诱导结直肠癌细胞凋亡与Caspase的相关性
为了进一步明确5F 诱导的凋亡是否与Caspase依赖的机制有关，本实验使用了Caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk。分别将SW480、HCT116细胞在加或不加z-VAD-fmk（50 μmol·L-1）培养1 h后，再加或者不加5F（100 μmol·L-1）作用24 h。如图4所示，Western blot检测结果显示，与5F单独处理的结直肠癌细胞Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达明显相比；
5F和z-VAD-fmk共同作用的结直肠癌细胞Cleaved Caspase-3（P＜0.01）、Cleaved PARP（P＜0.01）蛋白表达显著下调，表明z-VAD-fmk可阻断caspase激活。说明5F诱导的凋亡与Caspase 依赖的机制有关。
图4 5F联合z-VAD-fmk处理对SW480、HCT116细胞Caspase-3及PARP蛋白的影响Fig 4 Effect of 5F combined with z-VAD-fmk on Caspase-3 and PARP proteins in SW480 and HCT116 cells
3.5 5F诱导结直肠癌细胞凋亡与Bax 和Bcl-2的相关性
如图5所示，不同浓度的5F分别处理SW480、HCT116细胞24 h，随着5F浓度的增大，Bax蛋白表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平下降。表明5F可通过改变Bax、Bcl-2蛋白的表达促进细胞凋亡。
图5 5F对SW480、HCT116细胞Bax和Bcl-2蛋白的影响Fig 5 Effect of 5F on the expression of Bax and Bcl-2 proteins in SW480 and HCT116
3.6 AO染色观察5F对结直肠癌细胞酸性小泡细胞器的影响
AO染色可使细胞核和细胞质染成绿色，酸性囊泡被染成红色[6]。图6所示，AO染色法观察不同浓度的5F对SW480、HCT116细胞酸性小泡细胞器的影响。结果显示，25、50 μmol·L-1的5F分别处理结直肠癌细胞24 h后，细胞内被AO染成红色的酸性小泡有增加趋势；
100 μmol·L-1的5F处理结直肠癌细胞24 h后，代表酸性小泡的红色荧光反而减少。
图6 AO染色观察5F对结直肠癌细胞酸性小泡细胞器的影响（×200）Fig 6 Effect of 5F on acidic vesicular organelles in CRC cells by acridine orange staining（×200）
3.7 5F对结直肠癌细胞LC3蛋白表达的影响
LC3在自噬的发生中扮演着重要的角色。LC3-Ⅱ是自噬体形成的特异性蛋白标志物，LC3-Ⅱ的量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率可能与细胞内自噬囊泡的量成正相关。图7所示，Western blot显示，SW480、HCT116细胞经5F处理 24 h后，在0～50 μmol·L-1内，随着5F 浓度的增加，LC3-Ⅱ的蛋白条带逐渐变深；
而100 μmol·L-1的5F处理组，LC3-Ⅱ的蛋白表达明显减少。提示一定浓度的5F有诱导SW480、HCT116细胞自噬的作用，而100 μmol·L-1的5F处理结直肠癌细胞主要引起细胞凋亡。
图7 5F对SW480、HCT116细胞LC3蛋白的影响Fig 7 Effect of 5F on LC3 proteins in SW480 and HCT116 cells
3.8 5F处理结直肠癌细胞自噬与凋亡的关系
为探讨5F诱导的结直肠癌细胞自噬与凋亡相互关系以及对细胞存活率的影响，本实验用50 μmol·L-1的5F联合10 μmol·L-1的氯喹处理结直肠癌细胞，检测其对自噬标志蛋白LC3、凋亡相关蛋白表达和细胞存活情况的影响。结果如图8所示，与5F组相比，5F联合氯喹处理组LC3-Ⅱ蛋白表达增加，Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP表达明显减少（P＜0.01）。说明自噬受到抑制，凋亡也下降。图9所示，与50 μmol·L-1的5F组比，同浓度的5F联合氯喹处理结直肠癌细胞后细胞存活率增加（P＜0.01）；
与100 μmol·L-1的5F组比，同浓度的5F联合氯喹处理结直肠癌细胞后细胞存活率几乎不变。
图8 5F与氯喹联用对SW480、HCT116细胞自噬标志蛋白LC3以及凋亡相关蛋白的影响Fig 8 Effect of 5F combined with chloroquine on LC-3 and apoptosisrelated proteins in SW480 and HCT116 cells
图9 5F联合氯喹对SW480、HCT116细胞存活率影响（n＝5）Fig 9 Effect of 5F combined with chloroquine on cell viability of SW480 and HCT116 cells（n＝5）
细胞凋亡是机体细胞在发育过程中或一定条件下，受内在基因调控的细胞自主有序死亡，其在生理及病理性死亡、机体的生长发育以及细胞分化等方面发挥重要作用[7]。肿瘤细胞过度增殖，凋亡通路受阻可导致肿瘤的发生和发展。很多中药有效成分通过诱导细胞凋亡从而发挥抗肿瘤活性。本研究发现半边旗二萜化合物5F能显著抑制结直肠癌细胞增殖，浓度越高抑制作用越强；
Hoechst 33342染色表明5F处理结直肠癌细胞出现凋亡特征。依赖胱天蛋白酶（Caspase）的信号传导途径是细胞凋亡的途径之一[7-9]，z-VADfmk是应用非常广泛的Caspase广谱性蛋白抑制剂[10-11]。研究发现z-VAD-fmk可减弱5F诱导的结直肠癌细胞凋亡，说明5F诱导的结直肠癌细胞凋亡是Caspase依赖的凋亡。Caspase 家族中最重要的凋亡执行者Caspase-3更被称为“死亡执行蛋白酶”，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是死亡受体通路和线粒体通路执行细胞凋亡的关键执行子[12]。PARP[poly（ADP-ribose）polymerase]是一种蛋白翻译后修饰酶，在细胞修复与凋亡的调控中起重要作用，是 Caspase-3的底物之一，可被活化的 Caspase-3 切割分解而失活，从而导致细胞凋亡[13]。本课题的研究表明5F可诱导结直肠癌细胞中Pro-Caspase-3 转化为Cleaved Caspase-3 蛋白，效应性的 Caspase可裂解下游的PARP，出现Cleaved PARP，而PARP的降解失活使染色质DNA遭到破坏，使结直肠癌细胞失去保持稳态的能力从而发生凋亡。Bcl-2家族蛋白对细胞的凋亡起调节作用，Bcl-2是抗凋亡的负调节因子之一，当细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡；
Bax是促凋亡的正调节因子之一，能促进细胞凋亡；
Bax/Bcl-2 比值可作为判断细胞是否凋亡的参考[14-16]。5F可通过上调Bax，下调Bcl-2蛋白的表达促进细胞凋亡。
自噬和凋亡是细胞命运调节的两种基本病理生理机制[17]。自噬和凋亡之间的相互作用非常复杂，然而，这些相互作用可分为三类：① 自噬与凋亡，两者均以同步方式诱导细胞死亡，或在促进细胞死亡中起主导作用（协同作用）；
② 自噬通过诱导凋亡促进细胞死亡；
③ 自噬抑制凋亡诱导的细胞死亡[18]。姜黄素类似物EF24对A549细胞处理中自噬促进细胞凋亡，而EF24浓度为16 μmol·L-1时，A549细胞以凋亡为主[19]。本研究发现，AO染色表明5F处理结直肠癌细胞出现自噬特征，但100 μmol·L-1的5F诱导的细胞自噬明显减少。与此结果一致，低浓度5F处理结直肠癌细胞时，自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达增加，而100 μmol·L-1的5F处理的结直肠癌细胞LC3-Ⅱ蛋白表达明显降低。5F与自噬抑制剂联用，削弱了低浓度5F对结直肠癌细胞的抑制作用，表明5F通过自噬从而抑制结直肠癌细胞的生长。但当100 μmol·L-1的5F与自噬抑制剂联用时，并没改变结直肠癌细胞的存活率，表明100 μmol·L-1的5F处理结直肠癌细胞主要引起细胞凋亡。
综上所述，5F可通过增加Bax蛋白，降低Bcl-2蛋白，影响下游成员Cleaved Caspase-3 以及Cleaved PARP等蛋白表达，从而促进结直肠癌细胞凋亡；
低浓度的5F还可诱导结直肠癌细胞发生自噬，自噬对凋亡起促进作用；
高浓度的5F主要诱导结直肠癌细胞凋亡。本研究为5F防治结直肠癌奠定了实验基础，为将来进一步利用自噬促进剂从而达到细胞死亡的目的以及选择最优的药物浓度防治结直肠癌提供研究方向。
