李凯航 王浩臣 程可心 杨艳 金一 何晓青
（北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）
自然界中，正常生长的植物表面和植物内部富集了数量庞大且种类繁多的微生物，这些微生物的集合被称为植物微生物组［1］。植物为微生物组（包括细菌、真菌、原生生物、线虫和病毒）的生长繁殖提供生态位点，在植物微生物组中数目最多的是细菌和真菌［2］。植物的健康与高度多样化和动态的微生物组有关，微生物组对其宿主具有重要的功能［3-5］，在促进植物矿质元素吸收、提高植物抗病性、协助植物抵抗非生物胁迫、直接调节植物生长发育等方面有重要影响［6-7］。植物与微生物的互作现象及其机制，是生命科学研究关注的热点，也是利用微生物的关键问题。目前只有一小部分微生物与植物的相互作用得到了深入研究，其他大量微生物种类与功能缺乏系统性研究，它们与植物的互作机理尚不清楚［8-9］。随着国内外微生物组研究的开展，植物微生物组的整体功能更受关注，阐明植物-微生物组互作的遗传机制及互作在促进植物健康中的作用，将为植物的优良性状培育提供新的思路，具有重要的科学意义和应用价值。
随着测序技术和统计学的发展，GWAS 已成为有效方法来识别与微生物组相关的植物遗传变异［4］，并且已经被应用在多种植物上［10-14］。GWAS 是利用全基因组范围内群体中高密度的分子标记，鉴定与复杂性状表型变异相关联的分子标记，进而挖掘与表型相关基因的方法。宿主由于基因型的差异直接影响了表型的变化，因此，GWAS 已经被广泛应用于动物和植物以及人体的研究中［15-17］。而由于宿主基因型差异而改变的植物微生物组，同样影响着植物的健康，可以将微生物组的差异作为植物的“拓展表型”，并利用关联分析找到影响植物微生物组的基因［4］，为分子育种等提供重要的理论基础和遗传资源，是未来研究方向的热点。在植物与微生物组GWAS 分析中，如何表征微生物组差异并用于后续关联是保证结果准确性的关键以及难点所在。
植物并非单独存在，而是与多样化的微生物共存，在环境、宿主植物与微生物以及微生物与微生物之间的相互作用下共同塑造植物相关的微生物群落［7］。在不同的生态位展现了一个多样性的植物微生物组，主要包括根际微生物组、叶际微生物组以及内生微生物组。受宿主和环境双重影响，不同区系的微生物组在组成和功能上存在差异，是植物与土壤、大气交互作用的媒介。
土壤作为微生物种子库，为植物提供了丰富的微生物资源［18］。根际微生物主要来自于土壤，并召集了特定的微生物［19］。Wang 等［20］研究发现微生物的绝对数量从土壤到根际是逐渐增加的，提出根际微生物组“扩增-选择”组装新模型。有研究表明，相比于土壤，根际中的变形菌门、放线菌门和厚壁菌门细菌略有增加［2,21］，根际微生物中的复杂微生物群落具有活化根区养分、促进植物生长、增强植物抗逆、抑制土传病害等功能［22-27］。除了根瘤中的固氮细菌外，与自然界植物相关的其他根际微生物也已成为植物氮素营养的巨大来源［28-29］。植物定殖细菌甚至可以调节植物开花的时间［30-31］，还能帮助宿主避免灭绝的风险［32］。最近的研究表明，植物根际微生物群可缓解植物干旱胁迫，使作物的生产可持续进行［26,33］。叶际能够过滤来自更广阔环境的微生物，并允许特定类型的微生物在植物定殖，进而服务于宿主和叶际生态系统［34-36］。叶际微生物组主要由变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门组成，其中变形菌门占群落组成的近50%［2］。叶际微生物组也已被证明会影响宿主健康和生长、对非生物胁迫的恢复力和对病原体的抵抗力，具体包括固氮作用、通过产生VOCs 提高抗逆并且阻止病原菌侵染、介导植物防御、抗干旱和紫外线以及促进植物代谢等［37-39］。植物内生菌群经常富含有变形菌门和厚壁菌门，而拟杆菌门的含量则较低［2］，内生菌在促进植物生长、提高抗病性和缓解胁迫耐受性也发挥了重要作用［2］。根际内生菌可以帮助抵御病原菌的入侵，水稻种子内生菌可以帮助抗病等［40-41］。
植物相关微生物组的巨大功能潜力已经得到证实，宿主因素对微生物组的影响也进行了大量的研究［42-43］。在特定的土壤类型及环境下，植物微生物组差异主要由宿主调控［44-45］。植物在募集微生物组、筛选有益微生物并且抵御有害菌以及调控微生物之间的互作等方面发挥重要作用。不同植物品种及基因型在对微生物的募集上表现出明显的差异［21,26,46-47］。植物基因型影响了根系代谢物、免疫系统功能及根系分泌物的组成，进而影响了微生物组的活动与结构［6,48］。在面对生物或者非生物胁迫时，植物会通过遗传因子整合胁迫信号并参与主动重塑植物微生物群，利用“呼救”（cry for help）策略招募有益菌［46,49-50］，例如，小麦植株招募嗜麦芽寡养单孢菌（Stenotrophomonas rhizophilaSR80）来抑制土传病原体［51］。甜菜根在根内层富集噬几丁质菌科（Chitinophagaceae）和黄杆菌科（Flavobacteriaceae），这促进了植物抗真菌［40］。在最近的一项研究中，通过比较已感染受柑橘黑点病菌Diaporthe citri和未感染受柑橘黑点病菌D. citri柑橘叶之间的叶际微生物组的变化，发现柑橘会主动招募有益菌（包括泛菌Pantoeaasv90 和甲基杆菌Methylobacteriumasv41等）［39］。对优先考虑的番茄数量性状位点的基因内容分析表明，各种根际菌系的不同招募有其遗传基础［52］。通过对143 个玉米自交系材料进行根系细菌群落组成研究发现，玉米根系细菌存在差异［53-54］。也有研究发现，由于物种继承了祖先的遗传物质和性状，亲缘关系越密切的物种比进化距离遥远的物种微生物组更相似［55］，说明宿主遗传因素影响了微生物组组成。Bergelson 等［42］总结了植物影响微生物组的主要通路，包括生物钟、生长发育、物理屏障、免疫系统、植物激素、初级代谢、次级代谢以及植物与微生物的共生。
2.1 植物基因型差异对微生物组网络的影响
微生物在植物的作用下，通过竞争或者合作等方式，形成网络结构来维持微生物组内部的稳定［6］。Xiong 等［56］研究发现，由于植物的选择效应，影响了植物微生物组群落构建及网络复杂度，网络复杂度从土壤到根际到植物内部逐渐降低，并以叶内最低。不同生态位的微生物组也因植物基因型因素的差异而有区别，包括根际和叶际等（图1）［29,34］。尽管研究人员已在多种植物中开展植物基因型影响微生物组结构的研究，但对植物如何控制微生物组平衡来影响其健康的探究相对不足［55］，参与招募并塑造微生物组的主要基因有待挖掘。
图1 植物基因型差异影响根际和叶际的微生物互作网络Fig. 1 Plant genotype differences affecting the microbial interaction network at the rhizosphere and phyllosphere
2.2 遗传力表征植物对微生物以及微生物组的影响
为了解释基因型和数量性状之间复杂的关系，育种学家和遗传学家已通过计算遗传力来表示基因型对表型的影响大小。某一表型数据遗传力越大，表示其与宿主基因型关系越大。植物微生物组差异作为一种数量性状，也将遗传力计算应用在植物基因对微生物组的影响上。诸多学者将植物微生物组丰度、α 和β 多样性等参数视为数量性状，估计它们的遗传力，辨别受宿主遗传因素调控的微生物群落，并进一步通过GWAS 分析挖掘导致植物微生物组可遗传的宿主遗传变异［11-12］。研究微生物组遗传力，一方面可以加强我们对植物微生物组互作的影响，另一方面也可以作为帮助我们筛选益生菌的途径，加强对有益微生物的利用。
针对于植物微生物组的遗传力，其大小并非表示后代传递微生物组的能力，更应该准确的表示为描述最终由宿主遗传引起的群落组装的决定性成分［57］。通过对玉米根际微生物研究发现，单个微生物遗传力大小范围为0.15-0.25，虽然相比于开花时间的和其他传统的农艺性状来说遗传力较低，但仍能体现出植物基因对特定分类群的影响。其中，遗传力较高的微生物普遍为α 变形菌纲，并且发现7 种核心微生物（多个样品中普遍出现的微生物）中有5 种属于高遗传力的微生物［54］。Brachi等［58］以拟南芥叶际微生物为研究对象，筛选出了既是可遗传的并且在微生物互作网络中为hub 微生物，属于原霉菌（Protomyces inouyei）。Li 等［59］计算了单个微生物的遗传力，发现有15 个属于网络中hub 微生物同样具有相对较高的遗传力（H2>0.10），包括变形菌门（Proteobacteria）、担子菌门（Basidiomycota）、子囊菌门（Ascomycota）以及放线菌门（Actinobacteria）。Deng 等［12］计算了高粱根际微生物组的遗传力值，以降维后的主成分值数据作为不同样品的微生物组结构，研究发现，第一主成分解释了微生物群落21%的方差，并且第一主成分遗传力为0.35，证明了在高粱中微生物组具有较高的遗传力。Wallace 等［11］对玉米叶际微生物组研究，计算出某些单个的微生物遗传力较高，包括甲基杆菌属（Methylobacterium，H2=0.457）等，利用PICRUST 预测的方法，提出大量微生物功能也具有遗传性。
研究植物与微生物组的互作遗传机制需要构建系统的方法［4,19］。GWAS 是应对这一挑战的一个强大而灵活的方法，由于GWAS 分析只需要表型数据和基因型数据，通过鉴定对宿主基因型敏感的微生物或者微生物组，并将它们与影响其定殖的基因位点联系起来，帮助我们挖掘各种性状显著相关的数量性状座位（SNP）及其候选基因位点。因此，全基因组关联分析作为一种有效的手段帮助我们理解植物关键调控因子和相关信号途径如何主动重塑相关微生物组组装以及调控微生物组的稳定。
3.1 植物与微生物组关联分析的数量遗传模型的应用
GWAS 的基础是连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）［60］，LD 的大小主要受群体遗传多样性的影响, 在不同物种和群体中差异很大。GWAS 需要考虑的问题包括群体的选取、群体结构分析、表型鉴定、全基因组关联分析方法选择及结果矫正［61］。在选择微生物组作为植物的表型进行关联分析时，首先是考虑对样品的选择，样本量是保证结果可靠性的一个重要因素，一般选择200 个以上［62］。然后进行群体结构分析，群体结构分析主要分为两类，包括主成分分析（principal component analysis, PCA）和显示生成模型的方法［61］。在获得基因型数据和表型数据后进行关联分析时，由于宿主群体结构以及个体间的关系，会导致关联结果出现假阳性，在做关联分析时，我们需要考虑群体结构（G）和亲缘关系（K）。并将其作为协变量，通过引入一般线性模型（general linear model, GLM）和混合线性模型（mixed linear model, MLM）来矫正群落结构和亲缘关系的影响，计算膨胀系数并结合Quantile-Quantile 图选择合适的模型筛选显著性位点［61］。目前可用于GWAS的软件包越来越多，Yin 等［63］利用R 语言，创建了rMVP 包，通过引入GLM、MLM 以及FarmCPU 三种模型，采用分块矩阵计算、并行加速、计算流程优化等策略，加快了计算。同时，更多的GWAS 模型包括Meta-GWAS、多表型GWAS 等，其用于植物微生物组关联分析上仍有待探索［4］。
3.2 微生物组差异作为植物表型的选择
在应用关联分析揭示植物对微生物组的调控中，如何表征以及量化植物体内的微生物组是我们需要思考的问题。传统的研究主要依赖于在实验室条件下开展植物与单一微生物的互作关系研究，很少在自然状态下研究微生物组与宿主植物共存的机制［1］，例如病原菌的丰度会影响植物健康，早期人们为了研究病原菌于宿主的关系，以病原菌丰度为表型数据调查植物对病原菌的调控［64］；
也有研究者对共生微生物进行研究，比如豆科植物和根瘤菌之间的关系［65］。随着测序技术的发展，扩增子测序使得人们可以了解到植物体内的微生物群落。因此也有不少研究以相对丰度最高的微生物为表型数据进行关联分析［10］。Bergelson 等［42］提出只考虑相对丰度高的微生物会忽略遗传力高的微生物，确定可遗传的微生物可能有助于建立宿主遗传变异和微生物生态网络之间的联系。
当前人们越来越重视微生物组，希望可以深入了解植物与微生物组的互作机制。已有多种表征微生物组差异的类型，包括α 多样性指数、β 多样性指数、微生物组功能差异、hub 微生物的相对丰度及网络特征值［4,13-14］。α 多样性主要关注局域均匀生境下的物种数目，因此也被称为生境内的多样性，包括了Chao1、Ace、Shannon、Simpson、Richness 等指数。β 多样性不仅可以反映样本之间的多样性距离关系，而且还可以反映生物群落之间的分化程度。其使用统计算法Euclidean，Bray-Curtis，Unweighted_unifrac，weighted_unifrac 等，计算两两样品间距离，获得距离矩阵，通过降维方式展示微生物组差异，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS 分 析）、非 加 权 组平均聚类分析（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）等分析方法，从中发现不同样品之间微生物组的差异。还可以利用一些功能数据来表示微生物组之间的差异，包括利用宏基因组展示微生物组功能差异、基于扩增子测序数据预测的微生物群落功能（利用PICRUSt、Tax4Fun、FAPROTAX 及BugBase 等方法）［66-67］。
植物微生物组之间通过互作方式形成复杂的网络结构，特别是细菌-真菌之间的相互作用，在植物生长中发挥重要作用［68］。在陆地生态系统的养分循环及植物群落动态等过程有重要调节作用［69-70］。微生物组差异也可以通过一些网络参数体现出来，其中，一些hub 微生物在网络中发挥重要作用，宿主也会通过影响hub 微生物来调控微生物互作网络［71］。因此，有研究利用不同样品间微生物互作网络中的hub 微生物为表型数据来代表不同样品之间的微生物组差异。通过了解对核心微生物的分析加强对微生物组的理解［13］。Jiang 等［72］用数学模型将微生物的竞争与合作系统分解为共生、拮抗、攻击和利他网络，He 等［14］整合行为生态学与基因作图理论，将网络嵌入到基因定位的框架，构建了网络作图模型（network mapping）（图2）。利用数学模型计算了不同互作关系下的六种微生物互作网络特征值（Connectivity、Closeness、Betweenness、Eccentricity、Eigenvector、PageRank），并以网络特征值来表征不同样品之间微生物互作网络的差异。
图2 网络作图研究植物与微生物组互作Fig. 2 Studying plant-microbiome interactions by network mapping
3.3 利用GWAS进行的植物微生物组研究
选择合适的微生物组表型差异数据后，可以将基因型数据与表型数据进行关联，挖掘调控微生物组的植物候选基因。Wallace 等［11］计算了玉米叶际微生物组的α 和β 多样性的多种参数（α 多样性指数计算了除Michaelis-Menten 之外的其他所有参数，利用加权的UniFrac、未加权的UniFrac 和Bray-Curtis 距离度量计算了β 多样性，同时利用PICRUST 的方法预测了微生物组的功能）并以此为表型数据进行关联分析，发现了影响玉米叶际微生物组的管家基因（包括AGPv3等）。在最近的一项研究中，通过对高粱根际微生物组进行分析，以不同高粱根际微生物组PCA 结果的第一主成分来表征不同样品间微生物组差异，选到RGA2、CHAF1A等基因，结果显示这些基因表现出较强的根特异性活性［12］。Koprivova 等［73］以拟南芥根际土壤中微生物组硫酸盐酶活性为表型数据，提出编码色素P450 的基因影响根际硫酸盐酶活性来反映出微生物组的差异。有研究以水稻叶际微生物互作网络中的hub 微生物的相对丰度为表型数据，获得了编码氧化氢同工酶、ATP 依赖的蛋白酶等的基因（OsNippo02g019000、OsNippo11g101050）［13］；
He 等［14］将 拟 南 芥 基 因型与根际微生物组网络特征值进行关联，筛选到一些影响拟南芥根系生长以及一些抗逆基因，例如TMK3，IBR1B等；
Li 等［59］同样利用网络作图发现一些在植物生长中发挥重要作用的基因也影响了拟南芥叶际微生物互作，包括ADA2B,HAL3A等。同时，我们总结了在不同植物以及不同生态位中与微生物组有关的植物基因（表1）
表1 与塑造微生物组有关的植物基因Table 1 Plant genes associated with the microbiome
植物与自身微生物组作为一个整体，对于植物调控微生物组组装的机制已有相关研究，微生物组在植物抗逆抗病等方面的作用也得到了广泛证实，植物微生物组对植物生长发育的影响及其与植物的互作机制是国际前沿研究领域和重点研究方向［21］。微生物组差异作为植物的“拓展表型”应用于GWAS 帮助我们寻找可以调控微生物组的显著位点，但是仍然有很多未来需要关注的方向。
首先，随着测序技术迅速发展，提高了我们对微生物组的认识。为了进一步研究植物对微生物组的调控，我们仍然需要从多组学的角度出发，来量化微生物组功能差异，包括代谢组学以及蛋白质组学等，并将其作为表型数据引入到GWAS 分析中成为未来发展的方向。其次，为了充分发挥植物与微生物组之间的有益协作关系，保证微生物组在可持续农业中发挥更积极的作用，将筛选到的显著基因应用到植物中，通过改善植物基因表达情况来操控微生物群的稳态或者优化微生物群，进而帮助植物健康生长和抵抗胁迫环境。
对于在关联分析中寻找到的益生菌，合成菌群（SynComs）作为一种有效的手段，已经尝试将微生物组利用在植物上［82］。有关微生物群落中枢纽菌株和关键物种的新信息为利用有益微生物提供了进一步的指导，通过培养和筛选核心微生物，进一步创制新型菌剂，作为挖掘利用微生物组的重要途经，加强对有益微生物的利用。
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