王松，冉栓，牛裕晴，吴杰，夏家红（华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏大血管外科，湖北 武汉 430022）
细胞焦亡（pyroptosis）是近年来新发现的一种程序性细胞死亡方式，多项研究表明焦亡参与了肿瘤、自身免疫性疾病、感染等多种疾病的病理过程。心脏移植排斥反应主要病理过程是抗原提呈细胞等固有免疫细胞捕获外来抗原并活化T 细胞等获得性免疫细胞，活化后的T 细胞通过直接杀伤或激活巨噬细胞等天然免疫细胞参与移植物的排斥反应。越来越多的证据表明焦亡可能参与到心脏移植排斥反应过程，本文将针对焦亡在心脏移植排斥中潜在作用的研究进展进行阐述，加深对移植排斥反应的认识，通过靶向焦亡的相关通路为临床治疗提供新策略。
细胞焦亡是近年来发现的一种由Gasdermin蛋白介导的细胞程序性死亡［1］，表现为细胞肿胀破裂，内容物释放。经典的焦亡途径是指病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）或者损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）被细胞模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别，从而激活下游信号，与前体半胱天冬酶（pro-Caspase-1）以及凋亡相关斑点样蛋白（ASC）组装形成炎症小体（inflammasome），再激活pro-Caspase-1，活化后的Caspase-1 切割二聚体状态Gasdermin，N 端Gasdermin 在细胞膜上形成孔道。同时被成熟Caspase-1 激活的IL-1β、IL-18 及HMGB1 等炎症因子，通过孔道释放到细胞外基质，导致细胞的焦亡。非经典焦亡途径主要由Caspase-11 介导。AIM2炎症小体作为PRR 来感受DNA 的损伤信号，AIM2介导的细胞焦亡不依赖于Caspase-1、IL-1β 及IL-18［2］。Caspase-1/4/5/11 都参与焦亡相关通路。Gasdermin 蛋白家族主要成员有GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD 及GSDME，而GSDMD 是其中重要成员之一，是细胞发生焦亡的执行者［3-13］。
焦亡与另外一种经典的程序性细胞死亡——凋亡不同。凋亡过程表现为染色质固缩，核膜破裂，形成凋亡小体，通过细胞内在分子程序导致细胞死亡，对周围正常组织及细胞无其他影响［7］。而细胞焦亡发生时胞核完整，仅细胞质发生肿胀，形成炎症小体，内容物流出，释放炎症因子，诱发细胞外部炎症［14］。
2.1 自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一种由自身免疫反应导致的肝炎。在AIH 中，辅助性Ⅰ型T 细胞（helper type Ⅰ T cells，Th1）刺激巨噬细胞分泌IL-1 和TNF-α，IL-1β 与IL-18 都属于IL-1 家族蛋白。伴刀豆凝集素A（concanavalin A，ConA）构建自身免疫性肝炎动物模型，经ConA处理后，NLRP3 炎症小体、剪切后的Caspase-1 以及IL-1β 表达上调。与野生型小鼠相比，NLRP3-/-小鼠肝细胞损伤明显降低，血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平降低，肝细胞匀浆中Caspase-1和IL-1β 蛋白水平下调［15］。其研究表明抑制肝细胞焦亡可以明显改善自身免疫性肝炎。
在酒精性肝炎中，敲除非经典通路中关键分子Caspase-11 可以抑制GSDMD 的激活，减少肝细胞死亡。焦亡的下游效应分子IL-18 被认为是促炎因子，同时也是重要的抗微生物细胞因子。但在酒精性肝炎中，IL-18 的缺乏并不能保护肝脏，反而会促进GSDMD 的激活，加速肝细胞死亡从而加重肝炎［16］。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是一种以肝脏炎症及肝脏纤维化为特征的非酒精性脂肪性肝病。近期有研究表明，在NASH 中，肝星状细胞吞噬细胞外NLRP3 炎症小体颗粒后通过经典途径激活Caspase-1，使肝脏星状细胞发生焦亡，导致IL-1β 的释放，过表达NLRP3 可以导致小鼠出现自发性肝纤维化，加重非酒精性脂肪肝炎［17］。
2.2 焦亡在自身免疫性脑脊髓炎中的作用：实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）动物模型是用来研究多发性硬化（multiple sclerosis，MS）自身免疫性疾病的理想模型。MS以神经系统炎症及脱髓鞘为主要表现，NLRP3 炎症小体在其中扮演着重要的角色［18］。作为NLRP3 下游，焦亡的关键分子GSDMD 在EAE 发病小鼠的中枢神经系统中表达升高，主要聚集在血管周围区域附近。使用GSDMD 敲除鼠诱导EAE 发现，外周髓系细胞的GSDMD 缺失抑制了免疫细胞向中枢神经系统的浸润，导致神经炎症和脱髓鞘发生的比例减少。此外，敲除GSDMD 减少了脾脏及引流淋巴结中T 细胞的活化和分化，并阻止了T 细胞浸润到中枢神经系统中，敲除小鼠Gsdmd 基因后，明显减轻EAE 发病严重程度［19］。另外有研究发现，在EAE 模型中少突胶质细胞发生焦亡后，可以募集更多的小胶质细胞在其周围聚集［20］。EAE 模型中，巨噬细胞中Vsig4 可以激活JAK2-STAT3-A20级联反应，通过抑制NF-κB 通路来降低NLRP3 及IL-1β 的表达。敲除Vsig4 明显加重EAE 的发病程度［21］。因此靶向Vsig4 调控细胞焦亡可能成为治疗多发性硬化的新靶点。但是AIM2 全敲小鼠诱导EAE 之后临床评分更高、神经炎和脱髓鞘更严重，这可能与AIM2 破坏了Treg 的稳定有关［22］。
2.3 焦亡在肿瘤中的作用
2.3.1 细胞焦亡在乳腺癌中的作用：乳腺癌中GSDMB 的高表达与肿瘤进展和对HER-2 靶向治疗反应差相关，高水平的GSDMC 表达与乳腺癌的预后不良相关［23-24］。这意味着GSDMB、GSDMC 有可能成为肿瘤预后不良的标志物。在使用EO771 大鼠肿瘤细胞构建原位乳腺癌模型中，野生型小鼠中IL-1β 的水平升高，肿瘤生长迅速且肺转移发生比例高。而Caspase-1 敲除的小鼠构建肿瘤模型，肿瘤生长明显减缓且肺转移明显减少。此外IL-1β 可以促进肿瘤及巨噬细胞表达趋化因子CCL2，募集髓系细胞到炎症部位，并促进巨噬细胞浸润到肿瘤中［25］。此外，IL-1β 还可以促进乳腺癌细胞的转移及增殖，增加的骨转移［26］。
2.3.2 细胞焦亡与肺癌：GSDMD 蛋白在非小细胞肺癌中表达明显升高，且GSDMD 的高表达会导致肿瘤侵袭性强，腺癌预后差。下调GSDMD 后，肿瘤细胞焦亡受抑制，凋亡增加，并通过EGFR/Akt 通路减弱肿瘤细胞增殖［27］。He 等［5］在巨噬细胞中也发现了类似的现象：GSDMD 敲除后，巨噬细胞不发生焦亡，而是通过Caspase-3/7 通路发生凋亡。模式识别受体AIM2 激活后形成炎症小体，在非小细胞肺癌细胞中高表达AIM2，可以增强非小细胞肺癌的活力以及加强其迁移能力，在体内促进肿瘤的生长［28］。以上研究表明，焦亡在肺癌中的水平与肺癌的炎症程度、转移能力及预后相关，有望成为重要的生物标志物。
2.3.3 细胞焦亡与黑色素瘤：联合使用BRAF 抑制剂及MEK 抑制剂是FDA 批准的治疗BRAFV600E/K突变的黑色素瘤的有效方法［29］。BRAF 抑制剂 +MEK 抑制剂诱导了GSDME 介导的焦亡细胞死亡，在GSDME 敲除小鼠中，肿瘤浸润的T 细胞减少，且在联合治疗中不发生焦亡［30］。另外一种模式识别受体NLRP1 不需要ASC 便可以激活Caspase-1 形成炎症小体，NLRP1 通过增强炎症小体和抑制巨噬细胞凋亡来促进黑色素瘤的生长［31］。因此，焦亡相关分子NLRP1 可能成为治疗人黑色素瘤的新靶点。NLRC4 在黑色素瘤中可以抑制黑色素瘤的生长，NLRC4 炎症小体由NLRC4、ASC 与Caspase-1组成，敲除ASC 与Caspase-1 不能抑制移植黑色素瘤的生长，说明NLRC4 抑制黑色素瘤的生长不通过NLRP3 炎症小体途径［32-33］。
随着研究的深入，细胞焦亡与肿瘤的关系逐渐被认识。细胞焦亡与肝细胞癌、胃癌、结直肠癌及白血病等都密切相关［4］。一部分肿瘤细胞可以有效调节肿瘤免疫微环境，激活T 细胞介导的强大抗肿瘤免疫反应［34］。靶向焦亡相关蛋白AIM2、NLRP3炎症小体、Caspase-1 以及Gasdermin 蛋白有望成为抑制肿瘤生长，治疗耐药性肿瘤、预防肿瘤转移的有效途径［34-38］。
实体移植目前仍然是终末期器官衰竭的最终治疗手段［39］。器官移植术后，移植物经历缺血/再灌注损伤、排斥反应等过程，天然免疫和适应性免疫在其中扮演着重要的作用。
3.1 焦亡与缺血/再灌注损伤：缺血/再灌注损伤（ischemic reperfusion injury，IRI）是指由于各种原因引起的缺血和血液灌注恢复引起的组织或者器官损伤。在肝、肾、肺及心脏移植中，缺血/再灌注损伤是影响早期功能恢复和长期存活的主要原因之一。之前的研究发现，其发病机制及治疗策略主要涉及线粒体的功能：电子传递体系、线粒体渗透性改变以及自噬相关。而最近的研究发现，焦亡在缺血/再灌注损伤中也有着重要的作用［40］。在体外肺灌注的过程中，来自供体肺的白细胞通过Caspase-1诱导的细胞焦亡来损伤肺移植物，如果清除这些白细胞或者抑制焦亡，可以明显延长肺移植物的存活时间［41］。SIRT1 激动剂在IRI 缺血性损伤期间，可通过Akt 依赖性代谢调节抑制NLRP3 炎性小体的激活［42］。多种焦亡相关抑制剂已被证明可通过抑制心肌细胞焦亡减轻小鼠心肌梗死面积、改善心功能障碍，抑制剂Ac-YVAD-cmk［43］与VX765［44-45］通过抑制Caspase-1 抑制心肌细胞焦亡,抑制剂MX1013可以抑制多种Caspase 蛋白激活［46］,大黄素（emodin）通过抑制GSDMD 表达从而抑制心肌细胞焦亡［47］。GSDMD 全敲小鼠对心肌IRI 具有抗中性粒细胞介导的心脏保护作用［48］。此外，使用MCC950 和Ac-YVAD-cmk 阻断焦亡通路的NLRP3 炎症小体或者Caspase-1 可以减轻因心脏骤停后神经系统损伤［49］。SHI 等［50］2021 年发现心肌缺血再灌注损伤选择性的激活心肌细胞中Caspase-11 而不是Caspase-1，从而剪切GSDMD。随后他们构建心肌细胞条件性敲除GSDMD（GSDMDflox/flox；
CreαMHC）的小鼠，发现在缺血/再灌注的敲除小鼠中心肌梗死面积明显减轻，LDH 释放明显减少，且心肌细胞凋亡没有明显差异。以上研究表明靶向焦亡可以明显减轻缺血/再灌注损伤。
3.2 焦亡相关分子与排斥反应：在2010 年有研究发现，在心脏移植急性排斥阶段，炎症小体相关的ASC 在移植物中升高，且IL-1β 升高，其中机制不明［51］，受体小鼠Nos2 敲除后，Caspase-1 的转录水平明显降低，减轻心脏移植排斥反应［52］，当时认为以上过程是细胞凋亡的结果，目前来看，此过程很有可能跟细胞焦亡密切相关。急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，GvHD）仍然是使用同种异体造血干细胞移植治疗恶性造血系统肿瘤的主要障碍。Caspase-11 激活后切割GSDMD，导致IL-1α 释放。Caspase-11 或者GSDMD 缺乏可以减轻同种异体造血干细胞移植后的肠道炎症、组织损伤，降低移植后的病死率。此外，Caspase-11 的缺乏不会产生移植物抗白血病效应，这对防止癌症复发至关重要［53］。在同种异体心脏移植中，冬凌草甲素（oridonin）可以通过NF-κB 通路抑制T 细胞的增殖和IFN-γCD4+T 细胞的分化，导致脾脏中Treg的比例增加，下调NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和IL-18 的表达，延长心脏移植物存活时间［54］。
此外，在器官移植排斥反应中，T 细胞起着重要作用，CD4+T 细胞是心脏移植和肾移植中急性排斥反应充分且必要条件［55-56］，目前有大量CD4+T细胞在器官移植急性排斥反应中的研究。CD4+T 细胞分为Th1、Th2、Th17、Treg 及Tfh 细胞亚群。阐明CD4+T 细胞与焦亡的关系，有望为防止心脏移植排斥反应提供新的治疗策略。NLRP3 炎症小体在CD4+T 细胞中组装然后激活Caspase-1 依赖的IL-1β 分泌，从而促进IFN-γ 的产生，进一步促进CD4+T 细胞分化为Th1 型辅助T 细胞，且此过程需要补体激活NLRP3［57］。NLRP3 缺乏影响T 细胞激活及Th1 的分化，还会调节致病性T 细胞向胰岛迁移［58］。有研究表明，NLPR3 抑制剂MCC950 显著降低Th1/17 的细胞比例及IFN-γ 和IL-17 的分泌，增加Treg 的比例及IL-10 的分泌，而且此过程是由IL-1β 和IL-18 分泌受抑制介导的，从而减轻同种异体器官移植及角膜移植的排斥反应［59-60］。靶向焦亡相关分子NLRP3 有望成为同种异体移植的新的治疗策略。此外，最近研究发现，AIM2 通过与RACK1-PP2A 磷酸化复合物的交互作用抑制AKT 的磷酸化，从而促进Treg 的稳定［22］。AIM2 通过增强Treg 的稳定，减轻适应性免疫应答。
作为天然免疫细胞的巨噬细胞，在免疫排斥反应中也发挥重要作用。在心脏移植术后患者心内膜活检中，有超过半数的移植物中存在炎症，有约1/3 的标本中没有CD4+和CD8+T 细胞，而是存在不同表型的巨噬细胞［61］。巨噬细胞有供体和受体两种来源，研究表明，供体来源的巨噬细胞调控心脏移植排斥反应和GvHD［62-63］。在慢性排斥反应中，单核巨噬细胞CX3CR1/CX3CL1 和RhoA信号通路的相关性为抗慢性排斥疗法提供潜在靶点［64］。移植物血管病变是慢性排斥反应的重要病理过程，有研究表明，PCSK9 抑制了移植物血管中巨噬细胞的募集及IL-1β 及IL-18 的表达，这与抑制NLRP3 的表达有关［65］。焦亡最早在巨噬细胞中发现，Caspase-1/4/5/11 被炎症小体激活后，切割GSDMD，N 端的GSDMD 在细胞膜上打孔，细胞发生焦亡，释放IL-1β 及HMGB1［1，5］。
细胞焦亡在多种疾病中主要发挥促炎效应，而在心脏移植排斥反应中，无论是由适应性免疫T细胞介导，还是由天然免疫巨噬细胞参与，炎症都在其中扮演着重要的角色。受限于目前研究手段，心脏移植后的缺血/再灌注损伤、急性和慢性排斥反应发生发展过程的界定尚未明确，它们间的交互作用尚待研究。有研究表明，高亲和力的CAR-T 细胞介导肿瘤靶细胞发生焦亡，释放炎症因子IL-1β及IL-18，可以募集更多的巨噬细胞在局部聚集［66］。IL-1β 可以促进巨噬细胞表达趋化因子CCL2，募集到炎症部位［25］。而在心脏移植排斥反应中，表达CCL2 的巨噬细胞调节排斥反应［62］，由此我们提出一种假设：在心脏移植后，T 细胞杀伤心肌细胞，导致心肌细胞发生焦亡，释放炎症因子IL-1β，募集供体高表达CCR2 的巨噬细胞向移植物聚集，进一步加强炎症反应，移植物焦亡将适应性免疫与天然免疫联系起来（图1）。靶向焦亡的执行者——GSDMD，有望切断上述联系，减轻移植物单核细胞的浸润，延长移植物生存时间，为减轻心脏移植排斥反应提供潜在的治疗新策略。
图1 细胞焦亡在心脏移植排斥反应中的作用假设图
细胞焦亡作为一种细胞程序性死亡方式，在多种疾病进程中发挥重要作用，其参与了自身免疫疾病、肿瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等病理过程。深入探究心脏移植排斥反应中焦亡的作用与机制有助于我们更进一步认识排斥反应的病理过程，靶向细胞焦亡有望成为移植物排斥反应治疗或辅助治疗的有效手段。同一种疾病中不同细胞的焦亡可能发挥同向作用或反向作用，挖掘心脏移植中不同细胞焦亡在其中发挥的作用及意义有望助于新一类抗排斥药物的研发。
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