徐永艳李 昆焦 蓉汪 琼王春涛郁步竹徐 荣
（1. 西南林业大学园林园艺学院，国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心，云南 昆明 650233；
2. 中国林业科学研究院高原林业研究所，云南 昆明 650233；
3. 玉溪师范学院，云南 玉溪 653100）
滇重楼（Paris polyphyllavar.yunnanensis）是云南道地稀缺名贵药材，通常以干燥根茎入药，具有消肿止痛、清热解毒、凉肝定惊、免疫调节等多种功效[1]，近年研究发现其对多种类型的肿瘤具有非常好的治疗效果，是云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片等中成药的主要原料[2]。滇重楼作为重要的中成药原料，目前已经分离和鉴定了甾醇及苷类、氨基酸、脂肪酸、多糖、黄酮等50 多种成分，其主要有效成分为甾体皂苷[3]。2015 年版《中国药典》规定滇重楼的含量标准为薯蓣皂苷（重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ）和偏诺皂苷（重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ）总含量≥0.60%[4]。近年来随着滇重楼药用范围不断扩大，每年消耗量远超出年再生能力，加之滇重楼根茎生长周期漫长、生长速度缓慢的特点，仍制约着人工种植业的发展[5]。此外，滇重楼皂苷合成分子机制尚不清楚，其产量及有效成分甾体皂苷含量无法短时期内提升，供不应求的窘迫现状仍未根本上得以改善[6]。
滇重楼传统入药部分为根茎，其地上部分的药用价值鲜有利用，在原材料极度缺乏的形势下，测定根茎以外其他组织器官如叶片、地上茎、新芽、花、须根、果皮、种子中总皂苷含量，可为充分利用滇重楼资源提供参考[7]。中药材有效成分积累是一个渐进的过程，主根等器官在不同生长年限所含皂苷单体种类及含量不尽相同，不同生长阶段皂苷单体种类及其含量也有所差别[8]。由此可见，重楼皂苷积累具备明显的时空特征，但是该特征迄今在国内外未见系统报道。因此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定滇重楼同一生长年限不同器官和同一器官在不同生长发育时期皂苷种类及其含量，总结重楼皂苷在植物生长过程中的时空变异和积累规律，可为滇重楼器官采收期的科学确定和滇重楼器官的综合、合理利用提供参考。
1.1 植物材料
选取前期筛选重楼皂苷含量较高、生长较快、云南普洱景东地理种源的滇重楼作为研究对象，选取30 株健壮7 年生植株于2020 年3 月定植在西南林业大学树木园苗圃（云南，昆明）；
采用70%遮阴网遮阴，统一水肥管理。经西南林业大学曾觉民教授鉴定为滇重楼（Paris polyphyllavar.yunnanensis）。按不同组织、生长季节分别取样，进行重楼皂苷含量测定。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器
Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪：G1322A脱气机、G1311A 泵、G1313A 进样器、G1316A 柱温箱、G1315B 检测器；
KQ-500E 型超声波清洗仪；
METRotavapor RⅡ旋转蒸发仪；
精度为0.01 g的天平。
1.2.2 试剂
重楼皂苷Ⅰ（YJ-111591）、皂苷Ⅱ（YJ-111592）、皂苷Ⅵ（YJ-111593）和皂苷Ⅶ（YJ-111594）4 种对照品均从中国药品生物制品检定所购买，供含量测定用。
1.3 试验设计与方法
1.3.1 滇重楼根茎1～5 a 龄段中皂苷含量的差异性分析
2020 年7 月随机选取滇重楼样株根茎1 年生、2 年生、3 年生、4 年生和5 年生部分切下，根茎的1 年生、2 年生等各组织区分见图1，本研究用根茎1～7 a 龄段表示。相同部位混样60 ℃烘干，加热回流法[9]提取总皂苷，采用高效液相法[10]测定各样品皂苷含量，设3 次重复。线性关系考察表明各标准品范围内与其峰面积呈良好的线性关系；
精密度试验RSD 结果为0.39%，说明所采用仪器精密度良好；
RSD 的结果表明供试品的溶液在24 h 内稳定性良好、方法重复性良好。
图 1 7 年生滇重楼根茎Fig. 1 A sketch of rhizome and stem of 7-year-oldP. polyphyllavar. yunnanensis
1.3.2 滇重楼不同组织器官中皂苷含量比较分析
测定比较根茎、叶片、地上茎、新芽、花、须根、果皮、种子等不同组织器官的重楼皂苷含量，2020 年7 月随机采样混样干燥后进行皂苷含量测定，3 次重复。
1.3.3 不同生长期滇重楼根茎皂苷含量的比较分析
分别于2020 年7 月、9 月、11 月底和2021年1 月、3 月、5 月底取样，随机取滇重楼样株根茎1 a 龄段混匀干燥后测定皂苷含量，3 次重复。
2.1 滇重楼不同年限根茎及其他组织累积皂苷含量的比较分析
滇重楼总皂苷成分以重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ为主，重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ为辅（表1、图2）。滇重楼中总皂苷集中于根茎部位，含量在7.1～15.7 mg/g 之间，2 a 龄段根茎含量最高，须根、茎、叶、花、芽、果皮、种子等器官中也检测到重楼皂苷，其含量在0.7～5.7 mg/g 之间，皂苷最高含量是最低含量的22.4 倍。滇重楼根部总皂苷含量高于其他组织器官，达到了显著差异水平（P＜0.05），不同生长年龄的滇重楼根部总皂苷含量差异显著（P＜0.05），根茎1 a 龄段的皂苷含量最低，根茎2 a 龄段含量最高。通过方差分析和多重比较可知，普洱景东种源滇重楼根茎4 a 龄段和根茎5 a 龄段两者之间差异不显著，其他不同组织器官两两之间的总皂苷含量均显著差异（P＜0.05）。
表 1 不同年限根茎及其他组织重楼皂苷的含量Table 1 Contents of saponins in the samples collected in different growth years of rhizome and other tissue
图 2 不同生长年限根茎及其他组织重楼皂苷含量HPLC 图谱Fig. 2 HPLC chromatograms in the samples collected in different growth years of rhizome and other tissue
2.2 不同生长发育期根茎皂苷累积的比较分析
通过观察景东种源滇重楼，总结其年生长规律如下：1 月（休眠期）、3 月（地上部分即将萌动）、5 月（花期）、7 月（结实期）、9 月（果实膨大期）、11 月（倒杆期）、1 月（休眠期）。通常植物在花期、果期会消耗大量养分，滇重楼的地上、地下生长高峰期交替进行，9 月前后，新芽（下1 年的茎叶）形成，滇重楼开始进入地下根茎快速生长期，12 月前后倒杆进入休眠期。该种源生长期长，倒杆时间比其他种源晚。
滇重楼1 年生根茎在不同生长发育期总皂苷成分以薯蓣类重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ为主（表2、图3）。总皂苷含量在1 月最高达8.655 mg/g，在5—11 月花果期总皂苷含量最低为6.117 mg/g。3 月底滇重楼已经完成了花芽分化，皂苷含量开始降低为7.922 mg/g，4 月其茎叶和花蕾同时出土，5 月开花皂苷含量持续降低至最低点6.117 mg/g，之后7 月结实期提高为7.155 mg/g，9 月果实膨大期又降低为6.285 mg/g，11 月倒杆期皂苷含量有所升高为6.961 mg/g。其中，景东种源滇重楼5 月和9 月、7 月和11 月的总皂苷含量差异不显著，1 月、3 月皂苷含量与其他时期均差异显著（P＜0.05）。
表 2 植株不同生长期重楼皂苷的含量Table 2 Contents of saponins in the samples collected in different growth stages
图 3 不同生长时期重楼皂苷含量的HPLC 图谱Fig. 3 HPLC chromatograms of saponins contents in the samples collected in different growth stages
本研究结果表明，滇重楼根茎、须根、茎、叶、花、芽、果皮、种子等器官均检测到重楼皂苷，根茎作为传统药用部位皂苷含量最高，基本均超过0.6%，叶片、须根、茎、花、芽、果皮和种子等部位均检测到重楼皂苷，含量从高到低排列为：根茎＞叶＞种子＞芽＞茎＞须根＞果皮＞花。除根茎外的其他部位的皂苷含量均未超过0.6%，但整个植株仍然具有开发利用价值，尤其是叶中总皂苷含量达0.16%～0.52%，建议提取利用。滇重楼根茎中2 a 龄段含量最高，随年份增加而降低，该结果与其他文献3 年生最高不同[11]，可能因为本试验中是取7 年生植株的两年生部位导致。推测皂苷从前体到合成需要较长时间，叶片是重楼皂苷的重要合成部位，合成后输送到根茎部储存，重楼根茎为重楼皂苷的“库”。与冯丽丽等[12]提出的重楼皂苷主要在植物叶绿体中合成，从地上部位向下运输主要在根茎和叶中储存的观点一致，也解释了叶中总皂苷含量相对较高的原因。本研究显示在不同生长年限根茎中，皂苷含量从高到低依次为2 a 龄段、3 a 龄段、4～5 a 龄段、1 a 龄段，与传统认知的7 a 左右为最佳采收期差距甚远，同一植株根茎皂苷含量在2 年生部位达到最高值，随年限增加呈递减趋势，推测重楼皂苷代谢为边合成、边分解的动态过程，达到某个阈值时，开始分解，有待于后期通过分子生物学手段进行验证。
本研究测定不同生长季节总皂苷含量高低变化规律为1 月＞3 月＞5 月、9 月＞7 月、11 月，花期和果期皂苷含量较低，与夏从龙等[13]测定的滇重楼在5 月、6 月份花期的皂甙含量最高，9 月、10 月份果期最低的结果不一致，可能因植物材料、栽培地的地域性及生态环境条件不同导致。但与西洋参测定的休眠期高于花果期皂苷含量的结果一致[14]，推测滇重楼花果期生殖生长消耗大量养分导致皂苷含量低。植物休眠期通常要完成花芽分化、生理后熟等重要生理活动[15-16]，1 月前后的休眠季节皂苷含量最高，可能是皂苷合成的中间产物转化为重楼皂苷。宜对不同生长期重楼皂苷合成主要基因同时进行qPCR 测定，与皂苷含量进行相关性分析，可以更加深入地从分子层面解析重楼皂苷的累积规律。前人研究认为甾体皂苷合成有甲羟戊酸通路（MVA）和非甲羟戊酸通路（MEP），MVA 为主要通路[17]。甾体皂苷骨架生物合成最后由β-糖苷酶与甾体糖基转移酶催化形成多种甾体皂苷[18]。尼二磷酸合成酶、鲨烯环氧酶、鲨烯合成酶等多种酶参与甾体皂苷合成[19]，环阿屯醇合酶（CAS）和鲨烯合酶（SQS）是滇重楼的主要有效成分甾体皂苷（三萜类物质）合成通路中的关键酶[20]。为进一步明确滇重楼皂苷合成通路，后期将利用高通量转录组测序，对滇重楼不同季节、不同组织器官进行分析。以期挖掘滇重楼皂苷合成通路中的关键基因并揭示其调控机制，为利用现代生物技术的基因调控手段提高滇重楼皂苷含量提供基础。
采收期是影响中药材产量和质量的重要环节之一，生产中滇重楼的最佳采收年限应综合根茎增长速率和皂苷增加速率来决定，选取经济效益最高时采收为宜，明确滇重楼器官皂苷积累时空特征具有重要意义。由于滇重楼资源日渐枯竭，叶中总皂苷含量达0.16%～0.52%，可部分替代根茎入药缓解供需矛盾。因此，本研究探讨了滇重楼根茎在不同生长年限、不同生长发育期及不同器官的总皂苷含量规律，可为生产中最佳采收期的确定和滇重楼器官的综合、合理利用提供科学依据。
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