王宇婷，金铁岩，王云峰，王龙宇，张智勇，熊思睿
延边大学农学院（延吉 133002）
假谷物也称为准谷物，并不是真正意义上的谷物，但与谷物有相同的营养成分及功能。假谷物中存在高质量的淀粉、膳食纤维、蛋白质，丰富的矿物质、维生素及其他的生物活性物质，可以为人体提供营养和能量，是重要的能源物质之一[1]。
紫苋籽粒（purple amaranth grain）是一种新型的粮食作物资源，被人们称为假谷物，并不是真正的谷物产品，它的成分和用途与小麦、大米等谷物相似，且不包含麸质[2]，目前作为优质的食品原料掺入谷物食品中[3]。紫苋籽粒中含有丰富的优质蛋白质、淀粉、脂肪、维生素、矿物质，膳食纤维及不饱和脂肪酸等其他生物活性，例如多酚[4]。紫苋籽粒粉中丰富的蛋白质、矿物质、维生素以及微量元素可以有效预防慢性疾病的发生。因此它的使用价值和营养价值较高。同时具有显著的降血压、降血脂、延缓衰老、预防慢性疾病的作用[5]，因此紫苋籽粒粉的保健功效和药用价值较高。而且有大量的研究证明，植物中多酚具有一定的抗氧化能力[6]。因此植物中的多酚被添加到保健食品中，充分发挥了紫苋籽粒的食用价值和药用价值[7]，进而生产出营养健康的食品，对此可以进行更深度的研究。
试验对乙醇提取紫苋籽粒中的多酚含量进行测定，得出最优提取的多酚含量，并对紫苋籽粒乙醇提取物（AEE）的抗氧化活性进行测定。研究表明紫苋籽粒多酚类物质的抗氧化性能力，可提升紫苋籽粒的利用价值，为开拓紫苋籽粒市场提供了理论数据参考。
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
紫苋籽粒粉末（延边悟德酱酒有限公司）；
体积分数为95%的乙醇（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司）；
没食子酸（色谱纯，上海源叶生物科技有限公司）；
DPPH标准品（色谱纯，上海华蓝化学科技有限公司）；
抗坏血酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；
ABTS标准品（分析纯，上海源叶生物科技有限公司）；
碳酸钠、氯化铁、铁氰化钾、福林酚、三氯乙酸、过硫酸钾、盐酸溶液、磷酸盐缓冲液（均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）。
1.1.2 主要仪器与设备
YP2002分析天平（上海科教仪器有限公司）；
GC-MS-QP2010电子天平（上海英展机电企业有限公司）；
U-3900紫外分光光度计（日立天美公司）；
Y-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；
SHB-IIIA型真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；
FD=1C-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；
101B电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 紫苋籽粒多酚含量的测定
测定多酚含量的原理是Folin-Ciocalteu试剂中多酚发生的还原反应。参考满朝坤[8]的方法检测多酚含量，并绘制没食子酸标准曲线：精密称取0.010 0 g没食子酸标准品置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解摇匀后定容至刻度线，获得0.10 mg/mL的没食子酸标准品溶液，分别准确移取0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL标准品溶液置于棕色容量瓶中，加蒸馏水至总体积6.0 mL，后加入0.5 mL福林试剂并搅拌均匀，在0.5～8 min内加入1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，充分搅拌，定容，在30 ℃条件下避光0.5 h，取6.0 mL无标准溶液蒸馏水作为空对照，在波长750 nm处测量吸光度，并平行测量每个样品3次。
1.2.2 紫苋籽粒提取物制备
紫苋籽粒粉过0.180 mm筛，放在-20 ℃的冰箱中储存备用。
将紫苋籽粒粉末与不同体积分数乙醇以不同比例混合，在25 ℃的条件下浸泡1～24 h后进行过滤，取上清液进行抽滤。得到的乙醇提取液利用旋转蒸发仪在减压下蒸发出乙醇和多余的水分，最后得到紫苋籽粒粉末提取物浸膏。将该浸膏放在-70 ℃的冰箱内冷冻后放在真空冷冻干燥机中储存，冻干后变成粉末，称重并密封储存备用[9]。
1.2.3 单因素试验
1.2.3.1 乙醇体积分数对多酚提取含量的影响
准确称取6 g紫苋籽粒粉，分别用体积分数为50%，60%，70%，80%和90%的乙醇提取剂，料液比按1∶30（g/mL）混合，浸泡24 h后，得到上清液并采用福林酚法测定得到溶液中的多酚物质含量。
1.2.3.2 料液比对多酚提取含量的影响
准确称取6 g紫苋籽粒粉，使用体积分数为80%的乙醇为提取剂，分别按照料液比1∶5，1∶10，1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）混合，浸泡24 h后得到上清液并采用福林酚法测定得到溶液中的多酚物质含量。
1.2.3.3 提取时间对多酚提取含量的影响
准确称取6 g紫苋籽粒粉，使用体积分数为80%的乙醇为提取剂，料液比按1∶30（g/mL）混合，分别浸泡1，3，6，12和24 h后得到上清液并采用福林酚法测定得到溶液中的多酚物质含量。
1.2.4 正交试验
通过试验结果分析乙醇提取紫苋籽粒中多酚含量，其单因素的最优条件为料液比1∶30（g/mL）、乙醇体积分数80%、浸泡时间12 h，设计的正交试验因素水平如表1所示。
表1 试验因素水平表
1.2.5 DPPH自由基清除率测定
DPPH又称1, 1二苯基-2-三硝基苯肼，它是一种极其稳定的氮中心自由基[10]。测定植物提取物的抗氧化能力一般选择DPPH自由基作为衡量指标。DPPH的特征吸收峰位于517 nm附近。利用试验检测不同的吸光度对清除自由基能力进行评价[11]，该方法是研究体外自由基清除能力中用到最多的方法，此方法便捷，高效[12-13]。
将4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液分别与不同浓度的紫苋籽粒多酚提取液放置在试管中充分混匀，室温下避光约0.5 h，以无水乙醇与水体积比1∶1作为空白试验。
将维生素C（抗坏血酸）作为对照，处理方法同上，测定后计算紫苋籽粒多酚提取物对DPPH自由基清除率（%），按式（1）计算。
式中：A0为测定样品溶液在517 nm处的吸光度；
A1为紫苋籽粒提取物和无水乙醇溶液（1∶1）混合后的吸光度；
A2为DPPH溶液和无水乙醇混合后的吸光度。
1.2.6 ABTS自由基清除率测定
ABTS的特征吸收峰位于734 nm附近。通过检测吸收，从而评估ABTS自由基清除能力[14-15]。
制备ABTS工作液：准确称取4 mg过硫酸钾和12mg ABTS，配制出7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L过硫酸钾溶液。将配制完成的ABTS溶液与过硫酸钾溶液按1∶1混合，室温下避光放置12～16 h，再用无水乙醇将混合溶液稀释约50倍，确保其在734 nm处吸光度为0.7±0.02。分别提取4 mL不同浓度的紫苋籽粒提取液于试管，再加入16 mL ABTS工作液，混匀后静置6 min，检测其在734 nm处吸光度A0，将蒸馏水作为空白对照，检测其吸光度A1。
将维生素C（抗坏血酸）作为对照，处理方法同上，检测后计算紫苋籽粒多酚提取物对ABTS自由基清除率（%），按式（2）计算。
式中：A1为ABTS工作液与蒸馏水混合后测得的吸光度；
A0为紫苋籽粒提取物液与ABTS工作液混合后测得的吸光度。
1.2.7 Fe3+还原能力测定
把不同浓度的AEE移入试管，取5 mL在50 ℃下冷却0.5 h后取出。然后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，离心15 min。取5 mL悬液，依次加入5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%氯化铁溶液，搅拌均匀，反应约9 min后在700 nm处测量吸光度[16]。以抗坏血酸（VC）作为参照，操作方法同上。
2.1 乙醇体积分数对多酚含量的影响
根据图1可知，在只改变乙醇体积分数的条件下，用体积分数为80%的乙醇提取时得到的多酚含量最多（10.684 mg/g）。因此得出乙醇体积分数为80%时得到的多酚含量最优。
图1 乙醇体积分数对多酚提取含量的影响
2.2 料液比对多酚含量的影响
根据图2可知，在只改变料液比的条件下，在料液比为1∶30（g/mL）时提取得到的多酚含量最多（10.873 mg/g）。因此得出料液比1∶30（g/mL）时得到的多酚含量最优。
图2 料液比对多酚含量的影响
2.3 提取时间对多酚含量的影响
根据图3可知，在只改变提取时间的条件下，在提取时间为12 h得到的多酚含量最多（10.914 mg/g）。因此得出提取时间在12 h得到的多酚含量最优。
图3 提取时间对多酚含量的影响
2.4 正交试验结果
根据表2和表3分析得出，相对明显的影响因素有乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C），以上三个因素对紫苋籽粒乙醇提取多酚最优的理论方案是A2B3C3；
而正交试验结果的最优方案是A2B2C3，原因是正交试验因素水平较少造成的偏差。所以理论最优水平A2B3C3为最终的最优方案，即用配制好体积分数为80%的乙醇溶液浸泡，料液比1∶33（g/mL），提取时间12 h，在以上因素下称取6 g紫苋籽粒粉末进行试验，得到的多酚含量为10.914 mg/g，得到的结果比正交试验得好。
表2 正交试验结果
表3 方差分析表
2.5 紫苋籽粒提取物的DPPH自由基清除能力
如图4所示，DPPH属于强抗氧化剂[17]，如果维生素C的质量浓度为0.5 mg/mL，会被完全还原呈透明色。因此，在此浓度水平下AEE的自由基清除率为25%～38%。多酚提取物消除自由基的能力与剂量呈成正相关，即多酚提取物浓度越高，DPPH自由基消除能力越强，由此可见紫苋籽粒提取物的浓度与其抗氧化活性直接相关，该结果与之前的研究一致[18]。Shah等[19]也研究发现多酚类化合物可以作为质子供体发挥功能。所以，紫苋籽粒提取物中的化合物可能也存在相似作用。当其质量浓度为3 mg/mL时，AEE的自由基清除能力为75.43%。与阳性对照抗坏血酸相比，抗坏血酸对DPE的去除率显著低于对照组（P＞0.05）。如果其质量浓度超过3 mg/mL时，紫苋籽粒提取物的DPPH自由基清除率上升幅度较小。因此，利用乙醇提取能够获得活性更优的提取物，可以用于制作抗氧化剂。
图4 紫苋籽粒提取物的DPPH自由基清除能力
2.6 紫苋籽粒提取物ABTS自由基清除能力
如图5所示，AEE对ABTS自由基的清除能力较高。如果提取物的质量浓度低于2.5 mg/mL，AEE的清除能力在17.53%～58.94%之间。当质量浓度为3.5 mg/mL时，AEE对ABTS的去除率最高为61.02%，但显著低于VC。与DPPH自由基清除能力对比，AEE对ABTS自由基的清除能力不足。参考其他研究人员的结论，也证实了假谷物与普通谷物的ABTS自由基的清除能力都不算良好的结论[20]。
图5 紫苋籽粒提取物的ABTS自由基清除能力
2.7 紫苋籽粒提取物的铁离子还原能力
如图6所示，紫苋籽粒提取物和维生素C的铁离子还原性与其浓度呈正比，浓度升高则还原能力增强，但是紫苋籽粒提取物的还原能力不如维生素C。如果紫苋籽粒提取物的质量浓度达到4 mg/mL，AEE的吸光度是2.156，由此可见AEE具备铁离子还原能力。
图6 紫苋籽粒提取物的铁离子还原能力
紫苋籽粒提取物多酚含量比紫苋籽粒原料多，其原因可能是乙醇溶剂为物质发散提供液体环境并促进化合物或离子缔合[21]。紫苋籽粒在用乙醇体积分数80%、料液比1∶33（g/mL）、提取时间12 h的条件下含量最优。紫苋籽粒提取物对DPPH自由基、ABTS自由基和铁离子都有良好的自由基清除能力。其中紫苋籽粒乙醇提取物（AEE）的DPPH自由基清除能力最优。提取物的浓度越高，抗氧化活性和还原能力也随之上升。但是与相同浓度的维生素C溶液相比，AEE的抗氧化活性不高。
总之，由于紫苋籽粒提取物中有一定浓度的多酚，而多酚在自由基捕获和还原能力方面有所差异，追根溯源，紫苋籽粒提取物中多酚分子的酚羟基发挥协同作用从而发生对自由基清除能力的抑制是其主要原因[22]。有关分析显示，紫苋籽粒提取物的自由基清除和还原功能有所差异，这与提取物中的多酚有关，因此可研发以青紫苋籽粒为主要原料的保健食品。
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