宋 炜，张敬轩，马晓斐，崔小顺
(1.河北省煤田地质局环境地质调查院，河北 石家庄 050091；
2.河北冠卓检测科技股份有限公司，河北 石家庄 051130)
我国作为抗生素生产和消费大国，每年用量约为1.62×108kg，其中52%用于牲畜[1]。长期以来，兽用抗生素在控制畜禽传染病、感染症方面起了积极的作用，但因其在动物体内具有作用时间长、代谢慢等特点，使60%～90%的抗生素无法被畜禽吸收，而是以原药的形式随畜禽粪尿排出[2]，最终通过径流或浸出方式对土壤、水体造成污染[3]，并可能通过直接或间接方式进入食物链和人体，危害人类公共健康[4]。
近年来，随着农村产业结构的调整，规模化的畜禽养殖发展迅速，已成为一个独立行业，其产值约占我国农业总产值的1/3以上[5]，养殖业的迅猛发展提高了人们的生活水平，但也造成了一系列的环境污染问题[6]，尤其是农村地区，一些小型养殖场在实际养殖过程中，制度管理松散，滥用抗生素的情况普遍，对环境保护意识淡薄，导致含有抗生素的禽畜粪便随意倾倒和丢弃，造成环境污染。目前，对于大型、中型养殖场对环境的污染研究有很多[7-10]，但对于农村地区一些小型的养殖场的报道较少。本文选取了沧州市5个农村养殖场，分别于3月(春季)和6月(夏季)采集了周边近土及远土样品，采用液相色谱-串联质谱法对文献[7-10]中检出率较高的3类抗生素(TCs、SAs、QLs)进行定量分析，以揭示农村养殖场及其周边土壤中抗生素残留分布情况，并用风险商值法(RQ)对其生态风险进行评估，为农村养殖区的土壤检测和环境保护提供科学依据。
1.1 样品采集
本试验采集的土壤样品来源于5个农村养殖场(以1-5来表示)，其中3个为养鸡场，2个为养鹅场。分别于3月(春季)和6月(夏季)进行采集，周边近土样(以J表示)采集于距各养殖场10m附近的土壤，远土样(以Y表示)采集于距各养殖场50m附近的土壤，每个地块选取表层土壤(深度：0～20 cm)在不同方位采集4个点的土壤混合为一个土样，共计20个样品，剔除样品中的动植物残体、石块等杂物，根据四分法取1kg左右土壤样品装入带盖棕色玻璃瓶中带回实验室，并于-20℃存放一周后，使用冷冻干燥仪干燥，干燥后的样品经研磨后过60目尼龙筛，置于带盖棕色玻璃瓶中，于-20℃下保存。
1.2 样品测定
1.2.1 主要仪器及试剂
SHIMADZU-30A液相色谱仪(日本 岛津公司)；
AB SCIEX 4500 液相色谱-质谱联用仪(美国 AB SCIEX公司)，配有电喷雾离子源；
CT15RT 冷冻离心机(上海 天美公司)；
氮吹仪(上海 安谱公司)；
AE 200分析天平(法国 Mettler公司)；
Waters Oasis HLB 固相萃取柱(200 mg，6 mL， 美国 Waters 公司)；
强阴离子 SAX 固相萃取柱( 200 mg，6 mL，艾杰尔公司)；
涡旋混匀器(大龙兴创实验仪器有限公司)；
冷冻干燥仪(美国Virtis公司)。
乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯(德国 Merck 公司)；
标准物质甲氧苄啶(TMP)、磺胺索嘧啶(SIM)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺甲嘧啶(SMR)、磺胺恶唑(SMO)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺甲二唑(STM)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺多辛(SDX)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺异恶唑(SFZ)、磺胺苯酰(SBA)、磺胺喹沙啉(SQX)、磺胺苯吡唑(SPA)、氧氟沙星(OFX)、诺氟沙星(NFX)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(EFX)、洛美沙星(LOM)、沙拉沙星(SAR)、培氟沙星(PEF)、金霉素(CTC)、土霉素(OTC)、四环素(TC)、强力霉素(DC)标准品(德国Dr. Ehrenstorfer 公司)；
内标为环丙沙星-d8，磺胺二甲氧嘧啶-d6，地美环素，均购自北京振翔生物科技有限公司。实验用水由Millipore公司超纯水机制得。
1.2.2 样品前处理
准确称取经研磨的土壤样品5.0 g 于50 mL 离心管中，加入内标使用液100 μL(1μg/mL)，加入0.4g EDTA以及30 mL乙腈：磷酸盐缓冲液(pH=3)(1∶1,V/V)，涡旋振荡1 min，超声20 min，15 000 r/min离心 5 min，收集上清液，重复提取一次，合并提取液并混匀，过0.45μm玻璃纤维滤膜，于40℃的旋转蒸发仪上浓缩至15 mL以下，过SAX-HLB固相萃取柱净化(预先用10 mL甲醇、10 mL水、10 mL磷酸盐缓冲液(pH=3)活化)，用10 mL水淋洗SAX-HLB柱，并抽真空20 min，去除SAX柱，用10 mL甲醇洗脱HLB柱，洗脱液在40℃下氮气吹干，加入1 mL流动相复溶，溶液过 0.22 μm滤膜，待测。
1.2.3 测试条件
1.2.3.1 液相色谱条件
色谱柱：Kinetex C18色谱柱(50×3 mm，2.6 μm)；
流动相：A为0.1%甲酸水溶液；
流动相B为乙腈；
流速0.4mL/min；
梯度洗脱程序：0→2 min，8%B；
2→8 min，8%B→80%B；
8→11 min，80%B→80%B；
11.1→15 min，80%B→8%B；
柱温：40℃；
进样量：10μL。
1.2.3.2 质谱条件
离子源：电喷雾(ESI)电离源；
电离模式：正模式；
扫描方式：多反应监测(MRM)；
离子源温度：500 ℃；
雾化气压力：0.7 MPa；
气帘气压力：0.4 MPa；
辅助气压力：0.4 MPa；
电喷雾电压：5 500V。
1.2.4 质量控制
为了保证检测结果的准确性，将30种抗生素混合标准储备液、内标物质用甲醇稀释至不同浓度的混合标准使用液，以抗生素与内标物的浓度比值为横坐标、峰面积比值为纵坐标做标准曲线，得出所有抗生素的R2>0.99，方法检出限(S/N=3)范围为0.01～0.25 μg/kg。在空白土壤样品中分别添加1.0 μg/kg、10.0 μg/kg浓度的混合标准溶液，每个浓度取3个平行，各抗生素的加标回收率为61.0%～90.5%。
1.3 风险评估
本研究采用风险商值(RQ)来评估土壤中残留抗生素对生态系统的潜在风险，考虑到土壤中残留的抗生素不止一种，拟采用联合风险商值(RQsum)来表征生态风险，计算公式[11-13]如下：
RQsum=∑RQ
(1)
RQ=MEC/PNECs
(2)
PNECs=PNECw×Kd
(3)
PNECw=EC50/AF
(4)
式中：联合风险商值(RQsum)为各抗生素风险商值RQ之和。MEC为样品中抗生素的实测含量(μg/kg)。PNECs为土壤中的预测无效应含量(μg/kg)，由于土壤中抗生素的毒性试验数据较少，需采用水体中的PNEC值计算土壤中的PNEC值。PNECw为水中的预测无效应含量(μg/L)。Kd为土壤-水分配系数(L/kg)，通过文献[14-22]查得。EC50为急性毒性试验值(mg/L)，数据来源于美国EPA ECTOX数据库。AF为评估因子，采用急性毒性数据进行评估取值1 000[23]。按照RQ值大小进行风险等级划分，RQ≤0.1为低风险范围，0.1≤RQ≤1为中风险范围，RQ≥1为高风险范围。根据本次对采集的土壤样品中抗生素的检测结果，对于未检出的抗生素暂不考虑其生态风险性，其余抗生素的PNECs值见表1。
表1 土壤中抗生素的预测无效应含量
2.1 抗生素的残留浓度及分布特征
春季和夏季分别采集了5个养殖场的近土样和远土样，共计20个样品进行3类30种抗生素的检测，春季共有9种抗生素被检出，包括SAs 3种、TCs 3种、FQs 3种，检出浓度依次为ND～1.31μg/kg、ND～28.09μg/kg、ND～9.22μg/kg；
夏季共有8种抗生素被检出，包括SAs 2种、TCs 3种、FQs 3种，检出浓度依次为ND～1.21μg/kg、ND～20.02μg/kg、ND～8.31μg/kg，检出率由高到低均为TCs>FQs>SAs(表2)。从检出量来看，春季总检出浓度为171.24μg/kg，夏季为148.93μg/kg，单个抗生素在10个采样点中检出浓度最高的均为TC(春季28.09μg/kg，夏季20.02μg/kg)。除了OTC、OFX外，其余7种抗生素在春季的检出浓度高于夏季。
由图1(a)可知，20个样品中分别检出了不同种类的抗生素，呈现了不同的变化规律。春季检出SAs、TCs、FQs的浓度分别为5.39μg/kg、126.49μg/kg、39.36μg/kg，夏季检出SAs、TCs、FQs的浓度分别为4.32μg/kg、114.25μg/kg、30.36μg/kg，春季检出抗生素的种类及浓度水平高于夏季，可能是抗生素受温度、湿度等环境因素影响较大，加上与抗生素自身的降解性能有关。春季和夏季样品中，J1、Y1点检出的抗生素种类较少，近土样检出的抗生素种类大于远土样，且检出浓度是远土样的2倍左右，可能是该养殖场远土样点靠近河流，抗生素与土壤的吸附能力减弱，迁移能力增强，易随水流失。J2、Y2点检出的抗生素浓度较低，近土样和远土样的抗生素浓度基本相当，没有随距养殖场的距离远近而发生明显变化，可能由于该养殖场地理位置相对偏僻，日常以散养方式为主，抗生素使用量较少，抗生素的检出浓度可能与该地区土壤环境有关。J4和Y4点检出的抗生素浓度最高，且3类抗生素均有检出，该养殖场靠近居民生活区，可能与畜禽粪便和养殖污水的排放有关，还与生活污水的处理有关。J1-Y5点四环素类浓度较高，可能与其用量大有关，据研究[24]，京津冀地区四环素类抗生素在畜禽养殖中用量最大。总体而言，养殖场近土样品总抗生素的浓度水平高于远土样品，可能与近土样更易被禽畜粪便、养殖废水、生活废水等污染有关。
表2 土壤中抗生素的检出水平
备注：ND代表未检出。
图1 各种抗生素的检出浓度
如图1(b)所示，磺胺类抗生素春季检出了TMP、SMZ、SCP，检出浓度分别为0.61 μg/kg、2.32 μg/kg、2.46 μg/kg；
夏季检出了SMZ、SCP，检出浓度分别为2.03 μg/kg、2.29 μg/kg，春季的各种磺胺类抗生素的检出浓度和检出率均高于夏季。春季样品中检出了TMP，但夏季样品未检出，可能是夏季雨水增多，加速了磺胺类抗生素的迁移，降低了磺胺类抗生素的残留。春季和夏季的20种样品中，J2点磺胺类浓度低于Y2点，但J4点浓度高于Y4点，可能是由于磺胺类抗生素是人工合成的抗生素，难降解，因此在近土样和远土样中的浓度变化规律不明显。J1点检出了SMZ，但Y1点未检出，可能是Y1点靠近河流，抗生素易迁移至水流中[25]，使Y1点的残留浓度低于检出限。J1-Y5点整体磺胺的检出浓度不高，一方面是与磺胺类抗生素的使用量有关；
另一方面，相比于其他类型抗生素，磺胺类抗生素的吸附性能较弱但迁移能力较强，更易受周围环境的影响。
四环素类抗生素春季和夏季均检出了TC、OTC、CTC，检出浓度分别为春季：55.55 μg/kg、53.24 μg/kg、17.7 μg/kg，夏季：41.93 μg/kg、60.28 μg/kg、12.04 μg/kg，除了OTC外，TC和CTC的检出浓度在春季高于夏季，如图1(c)所示。在采集的20个样品中，J1—Y5点四环素类抗生素均有检出，可能与四环素的使用量有关，四环素类可作为抗菌助生长剂的药物，也可作为饲料添加剂用于畜禽动物的疾病治疗，虽然经过动物代谢、发酵处理，但其在土壤中仍具有较高的残留水平。TC和OTC的检出浓度较高，说明TC和OTC的使用量较大，J1点OTC在春季检出量低于夏季，可能是夏季采集样品前，与使用添加了OTC的饲料有关。J1、Y1点检出了CTC，其他点未检出CTC，可能与其使用量有关。J4、Y4点TC的检出浓度较高，除了与使用量较大有关外，可能与周围有居民生活区的环境影响有关。
从图1(d)可见，喹诺酮类抗生素春季和夏季均检出了EFX、NFX、OFX，检出浓度分别为春季：4.64 μg/kg、24.29 μg/kg、10.43 μg/kg，夏季：0.54 μg/kg、11.33 μg/kg、18.49 μg/kg，除了OFX外，EFX、NFX的检出浓度春季高于夏季，喹诺酮类抗生素的总检出浓度(春季39.36 μg/kg，夏季30.36 μg/kg)低于四环素类抗生素(春季126.49 μg/kg，夏季114.25 μg/kg)，这除了与使用量大小有关外，与四环素类抗生素相比，喹诺酮类抗生素更易受季节变化、温度变化的影响，雨季和高温都会降低抗生素的吸附能力，提高垂向迁移能力[26-27]，降低表层土壤中的抗生素残留水平，这也是春季的EFX和NFX的检出浓度比夏季高很多的原因。20个样品中，EFX在J5点检出，其余点未检出，检出率较低。J4、Y4点因周围居民生活区的影响，NFX和OFX的残留水平都较高，OFX的检出浓度春季低于夏季，可能是夏季采集样品前，与OFX的使用量(禽畜的使用和居民的使用等)有关。J2、Y2检出OFX，含量较低，可能与土壤背景环境有关。
2.2土壤中抗生素的风险评价
春季土壤中9种抗生素和夏季土壤中8种抗生素的生态风险RQ值，如图2所示。大部分采样点的单种抗生素的RQ值低于0.1，为低风险区域；
春季J1、J3、J4、J5、Y4点中检出单种中风险抗生素，包括SMZ、TC、EFX、NFX、OFX，生态风险商值RQ排序为J4>Y4>J5>J3>J1；
夏季J1、J4、Y4点中检出单种中风险抗生素，包括SMZ、TC、NFX、OFX，生态风险商值RQ排序为J4>Y4>J1；
在春季和夏季样品中，虽然四环素类抗生素的单种抗生素的风险水平均较低，但其Kd值较高，增强其在土壤中的吸附聚积能力，影响土壤中微生物的组成，对环境的生态风险存在潜在影响[28]。从联合风险商值RQsum来看，春季和夏季RQsum的范围分别为0.03～0.98和0.03～0.89，RQsum的平均值分别为0.31和0.23，中风险采样点个数分别为7和6，夏季的RQsum低于春季。春季J2、Y2点和夏季J2、J5、Y2点单种抗生素的RQ值表明是低风险，但RQsum值表明是中风险，说明当土壤中同时存在多种抗生素时，风险性会增加；
两个季节中J1-J5点的RQsum值均大于Y1-Y5点，可能与周边近土受禽畜粪便、养殖废水、生活污水等影响较大有关；
考察的5个养殖场，春季和夏季均J4点的RQsum值(分别为0.98和0.89)最高，土壤污染程度相对较重。土壤抗生素的残留对环境生物造成一定程度的危害，还可诱导抗性基因的产生，通过食物、地表水等途径进入动物体内后产生耐药性，威胁到动物和人体的健康[7]，为了降低土壤中抗生素的残留量，应加强抗生素的使用管理，建立生态化的畜禽养殖模式，提高人们的环保意识。
图2 抗生素风险评估
(1)养殖场及其周边土壤中，春季共有9种抗生素被检出，包括SAs 3种、TCs 3种、FQs 3种，检出浓度依次为ND～1.31μg/kg、ND～28.09μg/kg、ND～9.22μg/kg，检出率由高到低为TCs>FQs>SAs，其中TC的含量最高(55.55 μg/kg)，TMP的含量最低(0.61 μg/kg)；
夏季共有8种抗生素被检出，包括SAs 2种、TCs 3种、FQs 3种，检出浓度依次为ND～1.21μg/kg、ND～20.02μg/kg、ND～8.31μg/kg，检出率由高到低为TCs>FQs>SAs，其中OTC的含量最高(60.28 μg/kg)，EFX的含量最低(0.54 μg/kg)。这3大类抗生素在近土样和远土样中呈现不同的变化规律。
(2)由RQ值的风险评估结果表明，采集的土壤样品中春季有5种中风险抗生素，包括SMZ、TC、EFX、NFX、OFX，夏季有4种中风险抗生素，包括SMZ、TC、NFX、OFX。由RQsum值来看，春季和夏季RQsum的范围分别为0.03～0.98和0.03～0.89，RQsum的平均值分别为0.31和0.23，中风险采样点个数分别为7和6，夏季的RQsum低于春季，且当土壤中同时存在多种抗生素时，风险性会增加。总体来讲，养殖场周边近土的风险性高于远土区域，5个养殖场及其周边土壤中所检出的抗生素的RQ值和RQsum值均为中低风险水平。农村养殖场土壤中的抗生素的生态风险应引起关注，需加强对农村养殖场土壤中抗生素的风险管控。
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