钟新英,苏晓茹,张艺娜,张美芳,史晓丽
（宁德师范学院 生命科学学院，福建 宁德 352100）
对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖中毒害最大的病毒之一，其所导致的对虾白斑综合症传播速度快、破坏性强、防治困难，给我国乃至全球的对虾养殖业造成了极大的危害，制约了对虾养殖业的健康发展[1].据统计，我国每年因此造成的经济损失达到数千万元[2].为了降低该病毒的危害，在过去的数十年里，学者们开展了大量的研究工作，如控制水质量、切断传播途径、提高对虾抵抗力等，但是效果并不显著[3-6].
在WSSV 的侵染过程中，检测感染对虾的病毒含量是了解病毒侵染过程最重要方法之一.宿主的抗性也会影响疾病的暴发[7]，宿主中的病毒含量可以反应出它们对疾病的抵抗力及感染时期[8-9]，故病毒含量检测尤为重要.目前已有多种检测WSSV含量的方法，如原位杂交、免疫组化、一步法聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、多重PCR 和real-time PCR 等[10-11].在诸多方法中，real-time PCR 因其检测快速、灵敏度高，常被用于实时检测感染对虾病毒含量，目前已被应用于斑节对虾(Penaeus monodon)、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、日本对虾(Penaeus japonicus)等对虾的病毒含量检测[12-13].已有研究表明，在对虾养殖过程中，处于低浓度感染时，对虾不一定会暴发性死亡，携带少量病毒的对虾可以继续生存，如细角濒对虾(Litopenaeus stylirostris)体内病毒含量虽已达到2.1×103～2.72×105copies·ng-1，但其还可以继续生长且没有表现出任何临床症状[15].只有当对虾体内的病毒含量达到一定数量时，如凡纳滨对虾（Litope⁃naeus vannamei）为1.6×106copies·ng-1、细角滨对虾为4.3×105～3.0×106copies·ng-1、斑节对虾为2.1×106copies·ng-1时，对虾才会死亡[14].孟宪红[16]在中国对虾的研究中发现，不同感染时期（感染初期、高峰期和后期）对虾死亡个体的WSSV 含量分别为8.8×104～1.5×105、4.4×105～1.2×106、8.5×105～4.6×106copies·ng-1，死亡个体的平均WSSV 含量为9.5×106copies·ng-1，这也表明，WSSV 的感染程度和对虾死亡之间存在一定的关联.此外，不同对虾品种之间的差异也较大，如孙成波等[17]对凡纳滨对虾和斑节对虾致死量的研究发现，不同感染时间（感染后24、48 h 和濒死个体）2 种对虾携带病毒数量的范围为1.6×105～4.3×105copies·g-1，这也为实践中进一步优化对虾养殖条件、减少和控制WSSV暴发提供了理论基础.
凡纳滨对虾又称南美白对虾，具有抗逆力强、生长快、繁殖期长、耐低盐养殖等优点,是世界对虾养殖的三大品种之一，也是我国极为重要的养殖对虾[18]，但其养殖长期受到WSSV 病害的困扰.因此，本研究通过对凡纳滨对虾进行WSSV人工投喂感染，采用real-time PCR 技术，对不同感染时期的凡纳滨对虾组织样品进行病毒含量检测，观察感染WSSV后对虾体内病毒含量的增殖变化，以期为凡纳滨对虾养殖过程中WSSV的防治及抗WSSV育种提供参考.
1.1 实验材料
供试对虾购买自宁德对虾养殖场，购买后运输至宁德师范学院国家海洋局海西海洋生物种质资源及生物制品开放利用公共服务平台循环水养殖系统中进行暂养.暂养期间，每日投喂3 次配合饵料（日投喂量占对虾总体质量的3%～5%），每日换水，换水量根据摄食情况调整，温度在26～28 ℃之间，盐度27‰.对虾体长5～8 cm，体质量1.5～2.8 g，约500 尾.WSSV 人工感染实验前，随机选取5 尾对虾进行荧光定量PCR检测，确认对虾体内WSSV含量为阴性后再进行后续感染.
1.2 WSSV人工感染
采用单尾、口饲法对凡纳滨对虾进行WSSV人工感染.感染所用毒饵为中国水产科学研究院黄海水产研究所对虾遗传育种实验室馈赠，病毒含量为107copies·ng-1，加入可食用红色色素混合均匀后即可进行下一步感染，感染之前毒饵暂存于-80 ℃冰箱.感染之前，对虾先饥饿处理12 h，保证其肠胃排空.之后将对虾捞至单独容器中，用镊子夹取约10 mg毒饵送至对虾口器处，待对虾饱食后即可在胃部观察到明显的红色，然后将其放回至养殖桶.所有对虾饲喂完成后，正常养殖，并观察对虾死亡情况，及时捞出死亡个体.
1.3 样品采集及处理
实验开始后，从出现第一尾死亡对虾开始，每隔2 h捞取死亡对虾，记录其死亡时间、体重及水温，并取其肌肉组织保存于-20 ℃冰箱中，用于后续病毒含量的检测.
1.4 病毒含量测定
使用TIANGEN 基因组DNA 提取试剂盒对对虾肌肉组织的DNA 进行提取，DNA 提取结束后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计测定其浓度.采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II 对病毒的绝对含量进行测定（艾科瑞，湖南），引物由上海生工生物工程公司合成.荧光定量PCR 反应体系参考说明书，具体如下：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix II 10 μL，模板2 μL，引物各0.8 μL (10 μmol·L-1)，ROX 0.4 μL (4 μmol·L-1)，加无菌水补至20 μL.PCR 反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40 个循环.实验所用引物见表1；
实验所用标准品为自行合成的含有目标片段的重组pMD-T∕WSSV69 质粒，质粒浓度为5.0×108copies·μL-1，将标准品进行10 倍梯度稀释并对其进行扩增，采用灭过菌的双蒸水作为阴性对照，每个梯度设置3个平行.每个DNA样品平行检测2次，取其平均值作为该样品的病毒含量值.
表1 实验所用引物序列
1.5 数据处理分析
采用SPSS 22.0的单因素方差分析（One-way ANOVA）对对虾体内的病毒含量进行分析，显著性水平为0.05.
2.1 人工感染WSSV结果
对虾感染WSSV后的死亡情况见图1，感染34 h以后，开始出现死亡对虾，感染150 h为死亡高峰期，高峰期死亡85 尾，最后没有对虾存活，对虾最长存活时间为285 h，累计出池对虾487 尾，对虾平均体重（4.34±0.47）g.结合对虾死亡情况，我们把感染后的40～60 h定为死亡初期，感染140～170 h定为死亡高峰期，感染230～250 h定为死亡后期.每个时期选取20尾对虾进行基因组DNA的提取，统计分析病毒含量.
图1 凡纳滨对虾感染WSSV后的死亡情况
2.2 标准曲线制备结果
以标准品拷贝数的Log值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，得到的标准曲线的R2=0.998 2，且所有的阴性对照均没有扩增信号.
图2 质粒的标准曲线
2.3 对虾体内病毒含量分析
不同时期的死亡对虾体内的病毒含量结果见表2.随着感染时间的延长，死亡对虾体内的病毒含量在逐渐升高.感染初期、高峰期和后期，死亡对虾体内的病毒含量分别为1.37×105～4.47×106、1.92×106～1.30×107、3.75×106～1.90×107copies·ng-1，各感染时期的平均病毒含量分别为1.56×106、7.56×106、1.02×107copies·ng-1.应用独立样本T 检验分析各期对虾体内的病毒含量，感染初期和后期对虾体内WSSV 含量差异显著(P=0.023).
表2 死亡对虾体内WSSV含量
人工感染WSSV的方法包括饲喂、注射、浸泡等，其中，注射方法见效快，对虾死亡较快，但容易给对虾造成机械损伤；
浸泡方法不会产生机械损伤，但WSSV 一旦游离在海水中4 h就会失去感染活性[19]，故其浸泡效果不是很好.通常对虾主要是通过摄食携带WSSV的对虾或者卤虫导致病毒感染，所以本实验采用口饲的方法对对虾进行感染，符合自然状态下养殖对虾感染WSSV 的情况，这与逄锦菲[20]报道的研究方法类似，并且在感染过程中，随时捞出死亡对虾，有效防止了对虾残食带来的重复感染，确保了结果的准确性.
WSSV 在养殖池塘中一旦爆发，造成的死亡率可以达到100%、，但是不同的对虾种类、感染方式和感染剂量会影响对虾最终的死亡时间[19].如孙成波等[17]研究发现，通过注射的方式感染凡纳滨对虾和斑节对虾后，在低剂量感染的时候，凡纳滨对虾表现出了更明显的抗性，而在WSSV 剂量为6×104copies时，凡纳滨对虾体内的WSSV 含量在感染后的48 h，便达到了107copies·g-1，对虾的平均存活时间为79.5 h，而斑节对虾的平均存活时间仅为65.7 h.Durand 等[21]也研究发现，当用104copies 的WSSV 对对虾进行注射后，所有对虾在4 d 内全部死亡.逄锦菲[20]通过对中国对虾“黄海2 号”进行大规模的口饲WSSV 感染，发现感染后期死亡对虾体内的平均病毒含量为8.71×105copies·ng-1，对虾最长存活时间达到了602 h.本实验通过口饲法感染凡纳滨对虾，每尾对虾摄食的饵料中的病毒粒子达到了109copies，超过了很多学者通过注射或者浸泡测试对虾抗WSSV的剂量，最长的存活时间为285 h，说明了凡纳滨对虾对WSSV具有较强的耐受力.
已有研究发现，在经过WSSV感染存活的中国对虾个体内，病毒含量出现了两级分化的现象，有的对虾体内病毒含量很低（＜100 copies·ng-1），有的对虾体内病毒含量很高（＞106copies·ng-1）[20].孟宪红[16]也发现，在中国对虾大规模的WSSV感染中，最终存活的个体中有一半对虾体内的病毒含量小于100 copies·ng-1.Huang等[14]在凡纳滨对虾的研究中也发现，高抗家系存活对虾的WSSV 含量(23.84±2.56)×106copies·g-1显著低于其他家系，这就说明有的对虾是可以阻止WSSV 在体内复制的，而有的对虾可以耐受更高水平的WSSV 剂量，那些高抗性的对虾一方面可以阻止病毒的复制，另一方面还可以耐受一定的高水平的WSSV 剂量.本实验结束时并没有发现存活对虾，感染后期死亡对虾个体中的平均WSSV 含量在107copies·ng-1，最小和最大WSSV含量值仅差了10倍，差异不显著，没有出现两极分化的现象.但是在病毒含量的检测中，我们发现，早期死亡的对虾个体内的最小病毒含量仅为1.37×105copies·ng-1，随着感染时间的延长，死亡对虾体内的最小病毒含量达到了106copies·ng-1，说明在感染后期死亡的对虾对WSSV的耐受力更强，感染实验中存活时间久的对虾对WSSV的抵抗力显著强于存活时间短的对虾，这就为进一步开展抗WSSV相关的分子生物学研究奠定了基础.
本研究以商品化的凡纳滨对虾为实验材料，通过口饲的方法进行WSSV 感染，分析了感染后的WSSV含量变化，为解决凡纳滨对虾养殖过程中的WSSV病害防治提供了理论参考价值.
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