胡 尧， 岑 屹， 张步月， 吴文清， 程 伟， 黄铭颖， 刘爱平， 关 明
（复旦大学附属华山医院检验科，上海 200040）
毒性弥漫性甲状腺肿（Graves"disease，GD）是一种自身免疫性甲状腺功能亢进疾病，通常累及眼、皮肤、骨骼和心脏[1]。促甲状腺激素受体自身抗体（thyroid-stimulating hormone receptor antibody，TRAb）是GD诊断和预后判断的标志物[2]。TRAb可分为3类：中性TRAb、抑制性TRAb和刺激性TRAb。刺激性TRAb即促甲状腺免疫球蛋白（thyroid-stimulating immunoglobulin，TSI）[3]。根据TRAb的功能特点，TSI与促甲状腺激素受体α-亚基上富含亮氨酸的重复序列结构域结合后，能激活甲状腺细胞持续的信号转导[4]。因此，特异性检测TSI水平对GD的准确诊断具有重要意义。目前，TRAb的常规检测方法是基于单克隆抗体的化学发光免疫测定法，灵敏度较高，临床应用广泛，但该方法不能区分不同类型的TRAb[5]。有研究发现，双抗体夹心化学发光法可特异性检测TSI[6]。为此，本研究拟在评价双抗体夹心化学发光法检测性能的基础上探讨TSI在GD诊断中的价值。
1.1 研究对象
选取2020年10月—2021年1月复旦大学附属华山医院GD患者126例（GD组），其中男31例、女95例，年龄（37.2±13.2）岁，包括初诊患者41例、复诊患者85例。另选取同期复旦大学附属华山医院其他甲状腺疾病患者393例（对照组），其中男140例、女253例，年龄（42.1±16.0）岁，包括桥本甲状腺炎79例、甲状腺结节103例、甲状腺功能减退症96例、无毒性甲状腺肿59例、甲状腺囊肿56例。本研究经复旦大学附属华山医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 方法溯源性 采用IMMULITE 2000全自动化学发光免疫分析仪（德国西门子公司）及配套试剂（双抗体夹心化学发光法）检测TSI；
该方法溯源至世界卫生组织（World Health Organization，WHO）第2代促甲状腺受体抗体国际标准物质[由英国国家生物标准品和质控品研究所（the National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）持有，代码为08/240]。厂商提供的TSI参考区间为＜0.55 IU/L。采用cobas 8000 e 801 全自动电化学发光免疫分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂（电化学发光法）检测TRAb；
该方法溯源至NIBSC第1代国际标准物质90/672。厂商提供的参考区间为＜1.75 IU/L。TSI和TRAb的参考区间均经临床实验室所在地区人群验证通过。
1.2.2 精密度验证 根据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A3文件[7]要求，分别采用双抗体夹心化学发光法和电化学发光法检测2个水平的患者混合血清，每个水平重复测定5次，连续测定5 d，评估2种方法的重复性[变异系数（coefficient of variation，CV）]和总精密度（以CV表示），并与厂商声明的性能指标进行比较。
1.2.3 线性范围验证 根据CLSI EP06-A文件[8]，分别选取处于厂商声明的检测范围内的高、低水平临床样本各1份，将高水平样本（H）与低水平样本（L）按比例（L、3H+2L、2H+2L、2H+3L、H）进行稀释，得到5份系列稀释样本，每份样本重复测定3次，对数据进行多项回归分析，得到一阶、二阶和三阶多项式模型，对回归方程每个非线性系数做t检验，判断非线性系数与“0”的差异是否有统计学意义。要求任何确定为非线性的样本非线性量均低于厂商建议的线性目标（±15%或±0.5 IU/L）。
1.2.4 2种方法的相关性评价 根据CLSI EP9-A3文件[9]，采用Pearson相关分析评估TSI与TRAb的相关性。根据CLSI EP12-A2文件[10]，采用Bland-Altman一致性分析评估双抗体夹心化学发光法检测TSI与电化学发光法检测TRAb的一致性。比较TSI和TRAb的定性结果，对结果不一致的患者，由临床医生结合病史、其他实验室检查结果和甲状腺超声结果进行综合判断。采用Kappa检验评估GD组和对照组TSI与TRAb检测结果的一致性。
1.3 统计学方法
使用SPSS 13.0软件、MedCalc 18.2.1软件和Excel 2007软件进行统计分析。呈非正态分布的计量资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价TSI和TRAb诊断GD的效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 精密度验证结果
采用双抗体夹心化学发光法检测2个水平混合血清样本中的TSI，分别为0.95和19.5 IU/L，s分别为0.036、0.683 IU/L，重复性分别为3.8%、3.5%，总精密度分别为4.1%、3.6%，均低于厂商声明的重复性（4.8%、4.5%）和总精密度（5.8%、5.8%）。
采用电化学发光法检测2个水平混合血清样本中的TRAb，分别为1.5和21.0 IU/L，s分别为0.105、0.357 IU/L，重复性分别为7.0%、1.7%，总精密度分别为7.8%、2.0%，均低于厂商声明的重复性（7.8%、2.0%）和总精密度（11.0%、2.6%）。
2.2 线性范围验证
厂商声明的TSI和TRAb的线性范围分别为0.1～40.0和0.8～40.0 IU/L。线性评估结果显示，TSI的线性范围为0.33～8.50 IU/L，低值（0.27 IU/L）与理论值的偏差高于厂商声明（±15%），缺乏线性，最佳拟合回归曲线呈抛物线形，对非线性范围进行三阶多项式非线性系数t检验，最佳拟合回归曲线呈线性，见图1（a）。TRAb的线性范围为1.0～38.9 IU/L，且呈三项式最佳拟合线性回归，见图1（b）。TSI和TRAb线性范围的验证结果见表1。
图1 线性范围验证
表1 TSI与TRAb线性范围验证
2.3 TSI与TRAb的相关性
Pearson相关分析结果显示，TSI与TRAb呈正相关[Y=0.944 4X-0.668 3（r=0.930，P＜0.05）]。见图2。
图2 TSI与TRAb的相关性
2.4 TSI与TRAb的一致性分析
519例甲状腺疾病患者中，TSI阳性228例（43.9%），TRAb阳性216例（41.6%）。Kappa检验结果显示，TSI与TRAb的一致性较好（Kappa=0.83）。见表2。
表2 TSI与TRAb定性结果比较 例（%）
TSI与TRAb的总符合率为91.5%，但有44例患者检测结果不一致。查阅临床病历资料，发现在28例TSI阳性、TRAb阴性的患者中，有19例是服用甲巯咪唑治疗的GD患者；
在16例TSI阴性、TRAb阳性的患者中，有2例为GD患者；
有8例临床诊断为良性甲状腺结节或甲状腺囊肿，游离甲状腺素水平正常；
有6例临床诊断为桥本甲状腺炎。TSI检测结果与临床诊断的总体符合率为95.7%（497/519）。TRAb检测结果与临床诊断结果的总体符合率为93.4%（485/519）。
GD组TSI和TRAb水平分别为5.25（1.75～17.10）和6.86（3.25～20.30）IU/L，对照组分别为0.80（0.80～1.88）、0.10（0.10～1.20）IU/L。Bland-Altman一致性分析结果显示，对于GD组，双抗体夹心化学发光法检测TSI与电化学发光法检测TRAb的平均偏差为1.5 IU/mL，落在95%一致性界限外的百分比为4%；
对于对照组，2种方法的平均偏差为0.8 IU/mL，落在95%一致性界限外的百分比为4%。见图3。
图3 双抗体夹心化学发光法检测TSI与电化学发光法检测TRAb的Bland-Altman一致性分析
2.5 TSI和TRAb鉴别诊断GD的效能
剔除治疗后GD患者数据，采用ROC曲线分析TSI和TRAb鉴别诊断GD的效能。结果显示，TSI诊断GD的曲线下面积（area under curve，AUC）（95%CI）为0.89（0.86～0.91），最佳临界值为0.7 IU/L，敏感性为93.7%，特异性为85.1%，阳性预测值为94.0%，阴性预测值为86.0%；
TRAb诊断GD的AUC（95%CI）为0.86（0.83～0.89），最佳临界值为2.5 IU/L，敏感性为92.5%，特异性为86.7%，阳性预测值为92.0%，阴性预测值为85.0%。见图4。
图4 TSI和TRAb诊断GD的ROC曲线
GD是甲状腺功能亢进最常见的病因，GD的诊断通常基于甲状腺功能亢进的临床特征，包括心悸和怕热出汗，以及GD的明显特征，如眼眶病变和甲状腺肢端肥大。根据GD的诊断标准，TRAb是一个有效的检测指标，且应与甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸和促甲状腺激素联合检测[12]。以往放免法检测的TRAb仅能反映GD患者体内存在针对促甲状腺激素受体的自身抗体，不能反映这种抗体的功能，随着TRAb检测的敏感性和特异性的不断改善，TRAb不仅可以用于GD患者治疗效果的评估，还可用于GD的筛查[13]。
本研究结果显示，在精密度方面，双抗体夹心化学发光法检测TSI较电化学发光法检测TRAb表现出更好的性能。在线性验证中，2种方法呈相似的低值高偏差的非线性，随着分析物浓度的增加，出现抛物线线性反应，三项式曲线是其最佳拟合模型，与文献报道[14]一致。原因可能是TRAb属于自身抗体，具有异质性，在体外会产生低值非线性的稀释现象。双抗体夹心化学发光法检测TSI与电化学发光法检测TRAb之间呈高度正相关（r=0.930）。这是因为电化学发光法溯源至第1代国际标准物质（NIBSC代码：90/672），可检测所有类型的TRAb；
而双抗体夹心化学发光法溯源至第2代国际标准物质（NIBSC代码：08/240），可特异性检测TSI。根据厂商声明的参考区间判断，2种方法的总符合率为91.5%。
有研究结果显示，对于未经治疗的GD患者，TSI检测结果与TRAb检测结果之间一致性较好，但TSI对GD的诊断准确性更高[15-16]。TRAb检测的主要问题是慢性甲状腺炎伴甲状腺功能减退患者可能会出现假阳性结果，其原因可能与这些患者体内存在中性TRAb或抑制性TRAb有关。TOZZOLI等[6]的研究结果显示，桥本甲状腺炎患者TRAb会出现假阳性结果，假阳性率为3.6%。本研究结果显示，在2种方法检测结果不一致的44例患者中，6例桥本甲状腺炎患者的TSI结果均为阴性，Bland-Altman一致性分析结果与文献报道[6，17]一致。因此，TSI在鉴别GD与桥本甲状腺炎时更具特异性。一项多中心研究结果显示，双抗体夹心化学发光法检测TSI的结果与TSI生物法测定结果的一致性更高，TSI可作为我国GD患者的诊断指标之一，建议与TRAb检测联合应用，以提高诊断的准确性；
并建议建立不同地区人群相应的TRAb或TSI医学决定水平参考区间，以达到最佳的GD临床诊断性能[18]。由于人群、地区等的差异，不同研究中双抗体夹心化学发光法检测TSI与电化学发光法检测TRAb的敏感性和特异性可能存在一定的差异。张利霞等[19]对1 367例甲状腺疾病患者的研究结果显示，临床甲状腺功能减退组、亚临床甲状腺功能减退组TSI阳性率高于正常对照组，说明除GD患者会出现TSI阳性外，其他甲状腺疾病患者也会出现TSI阳性。钟丽等[20]的研究结果显示，TSI辅助诊断GD的敏感性为89.0%，特异性为94.7%。刘天琪等[21]采用与本研究相同的方法分别检测了48例甲状腺相关性眼病患者的TSI和TRAb，2个项目定性结果的符合率为89.5%。
综上所述，双抗体夹心化学发光法检测TSI具有可靠的分析性能，且与电化学发光法检测TRAb具有良好的相关性。TSI定量检测有助于提高临床对GD的诊断效率。
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