苏靖元，刘晓兰, 2，丛珊滋,2，李冠龙
(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院1，齐齐哈尔 161000)(黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室2，齐齐哈尔 161000)(黑龙江八一农垦大学食品学院3，大庆 163000)
我国高血脂症高发，并呈现上升趋势。高血脂症会诱发脂肪肝、高血压、动脉粥样硬化等多种并发症[1,2]。临床上治疗高血脂症的药物主要有他汀类、贝特类药物等，但长期服用会产生一定的副作用，如肝功能异常、肌肉不良反应等[3,4]。相比药物治疗，选择食用拮抗血脂功能的功能食品具有副作用低、安全性强等优势。
发酵豆制品因其悠久的历史、独特的风味和较高的食用价值具有重要的地位。发酵豆制品富含多种有益人体健康的活性成分，如大豆多肽、大豆异黄酮、γ-氨基丁酸(GABA)、类黑精素、纤溶因子等，具有促进脂肪代谢、预防心血管疾病、抗氧化应激、溶栓降压等功效[5-7]。
微波膨化技术在食品工业中得到了广泛的应用，其具有受热时间短、物料营养成分破坏少等优点[8]。大豆经微波膨化处理后，适度增加了体积，保留了原有的形状；
高温对大豆的营养物质产生变化，使蛋白质的空间结构发生改变、淀粉糊化等，且破坏了抗营养因子，有助于提高营养成分的利用率等作用，同时赋予了其特殊的口感和风味[9,10]。
本研究以3种膨化原料发酵豆制品纳豆、豆豉和豆酱为原料，建立小鼠高血脂模型，探讨其拮抗高血脂症功效，为拮抗血脂功能食品的研制提供参考。
1.1 实验动物、材料与试剂
清洁级ICR小鼠(22± 2)g，许可证号：SCXK(吉)2015-0005；
高脂饲料由15%(质量分数，下同)猪油、20%蔗糖、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠、63.6%基础饲料；
大豆、小麦粉：市售；
丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、总甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)试剂盒；
其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
P70D20TL-D4微波炉，BSA124S电子天平，SX-500高压灭菌锅，CR21G111高速冷冻离心机，GSP-9270MBE隔水式恒温培养箱，Alphal-4/1sc真空冷冻干燥机。
1.3 膨化原料发酵豆制品制备方法
1.3.1 纳豆的生产方法
原料预处理：选择颗粒饱满，粒度均匀，无破皮，无褶皱，无霉变，无虫蛀的小粒大豆。大豆除尘、清洗，浸泡过夜。
整粒微波：将预处理后的整粒纳豆放在微波炉专用保鲜盒内。先在120 W功率下微波40 min，再在450 W功率下微波25 min，使大豆既不全部胀开、又有一定体积膨胀度的适度变性，使其水分减少，口感酥脆即可，冷却至室温，密封备用。注意膨化时避免局部过热，导致膨化不均匀。
浸泡：用3倍处理后原料质量的水进行浸泡，20 ℃恒温条件下，静止浸泡1 h，使膨化大豆尽可能充分吸水。
蒸煮：将处理的原料，采用加压蒸煮方式，将膨化大豆进行加压蒸煮灭菌处理。利用高压蒸汽灭菌锅进行蒸煮，加压0.1 MPa、121 ℃条件下蒸煮15～20 min。熟豆应为黄褐色，熟而不烂。冷却准备发酵。
纳豆杆菌种子培养液的配制：采用纳豆杆菌作为纳豆的发酵菌株，先进行扩大培养，采用液体种子扩大培养方法。培养基选用牛肉膏蛋白胨培养基，取一环菌种，接入装有初始pH 7.0～7.5的50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃，180 r/min摇床培养16 h，制备纳豆杆菌种子培养液。
发酵培养：将经处理获得的原料放入无菌室，冷却至室温后接种，按6%的含水量加入无菌水和6%的接菌量，将摇床培养16 h的种子培养液接入原料中，混合均匀，将处理后膨化大豆放入37 ℃的恒温培养箱中恒温发酵24 h，将发酵后的大豆置4 ℃的冰箱中24 h进行后熟。
1.3.2 豆豉的生产方法
前处理工艺同1.3.1。
制曲培养：经处理获得的原料冷却后，将0.2%毛霉菌粉均匀洒在熟料中，翻拌均匀，维持在21～25 ℃，后期注意排水，制曲期间翻曲2次，时间为56～72 h。表面长满长2 cm左右白色绒毛即可。期间洗曲1次，注意豆曲不宜长时间浸泡在水里，以免含水量增加。
发酵培养：将处理后曲料加入调料，放在45 ℃的恒温培养箱内入坛密封发酵。具体调料配比添加：黄豆100 g，食盐8 g，白酒3 g，米酒4 g，冷开水5～10 g，总量配成165～170 g。
1.3.3 豆酱的生产方法
前处理工艺同1.3.1。
制曲培养：将经处理获得的原料冷却后拌入干蒸小麦粉，小麦粉与豆子的质量比例是1∶3。接种沪酿米曲霉种曲，接种量为原料质量0.2%，注意混匀。制曲采用2日曲，培养箱32～35 ℃培养。培养12 h左右，曲料发白进行第1次翻曲。表面长出绿色绒毛后进行第2次翻曲。
发酵培养：采用固态低盐保温速酿法。以经处理获得的原料与60～65 ℃盐水混合成固态酱醅，在45～50 ℃水浴锅中保温发酵，注意用棉塞封口，制成固态发酵豆酱。
3种膨化发酵豆制品冷冻抽干后研磨成粉用于灌胃。
1.4 动物分组及饲喂方法
小鼠适应性饲喂1周后，随机分成12组，每组8只，按清洁级动物饲喂，保持实验室环境卫生，自由饮食，分笼饲喂3周[11]。动物分组及饲喂方法如表1所示。
表1 小鼠分组及饲喂方法
每日称量并记录各组小鼠体重，末次灌胃后，小鼠禁食不禁水12 h，次日称体重，眼眶取血，静置后在4 ℃、4 000 r/min条件下离心10 min分离血清，将血清保存在-20 ℃冰箱中。解剖小鼠后取出肝脏，用预冷生理盐水洗去表面血液，滤纸吸干，称质量，切取一部分肝脏用于制备病理切片，剩下部分用锡箔纸包裹后存放于-80 ℃冰箱中备用。
1.5 指标测定
血清指标测定：取小鼠血清，按照试剂盒说明书测定血清中TG、TC、LDL-C含量。
肝脏指标测定：切取一定质量的肝脏，在冰浴条件下用生理盐水进行机械研磨，得到质量分数10%的肝组织匀浆，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，得到上清液。按照试剂盒说明书的方法测定肝脏组织中MDA含量以及T-SOD活力。
根据小鼠体重和肝脏质量计算肝脏指数，见式(1)。
(1)
式中：y为肝脏指数/%；
m为肝脏质量/g；
m0为小鼠体重/g。
1.6 肝脏组织切片观察
肝脏组织样品迅速浸泡在体积分数10%甲醛溶液中，脱水后嵌入石蜡内，切成5 μm厚的薄片，经苏木精-伊红(HE)染色后进行病理组织观察。
1.7 数据统计与分析
数据以均数±标准差表示，所有统计分析采用SPASS17.0软件中Duncan’s 检验计算统计学差异的显著性，P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。
2.1 小鼠高血脂模型的建立
模型组小鼠经过连续3周饲喂高脂饲料后，小鼠的体重、肝脏形态及血脂含量均发生显著改变。与对照组相比，模型组小鼠毛发杂乱、毛色不够鲜亮且小鼠活动度减少。对照组小鼠肝脏呈鲜红色，模型组小鼠肝脏呈土黄色、具有油腻感。与对照组相比，模型组小鼠血清中的TG、TC、LDL-C含量极显著升高(P<0.01)，分别提高了72.16%、72.78%、169.05%，表明小鼠高血脂模型建造成功。各组小鼠的血脂含量如表2所示。
表2 各处理组小鼠血脂含量(¯x±s,n=8)
2.2 膨化原料发酵豆制品对小鼠体重的影响
高血脂症与肥胖关系密切，体重指标可作为小鼠肥胖程度最直观的显示指标之一[12]。膨化原料发酵豆制品对小鼠的体重的影响如表3所示。
表3 膨化大豆原料发酵豆制品对小鼠体重的影响(¯x±s,n=8)
由表3可知，小鼠的初始体重基本一致，无显著差异(P>0.05)。经过3周连续饲喂后，各组小鼠的体重均有不同程度的增加。与对照组相比，模型组小鼠体重增量显著高于对照组(P<0.05)，增加了161.38%，说明通过高脂饮食可以显著增加小鼠的体重。与模型组相比，阳性对照组、纳豆各剂量组、豆豉各剂量组及豆酱中、高剂量组体重增量显著下降(P<0.05)。结果表明，经膳食干预后，膨化大豆发酵豆制品对高血脂小鼠的体重增量具有一定的抑制作用，与阳性对照组相一致，且呈良效关系，可以改善高血脂症所引发的肥胖。
2.3 膨化原料发酵豆制品对小鼠血脂含量的影响
脂类物质通过血液运输至机体内各个器官与组织之间，血液中的脂类物质含量可以直接反映机体内的脂肪代谢情况[13]。脂类物质指标包括TG、TC、LDL-C，高于正常水平的TG、TC、LDL-C是高血脂症的重要指标，并可以根据结果估计患心血管疾病的风险[14]。膨化原料发酵豆制品对小鼠血脂含量的影响如表4所示。
表4 膨化大豆原料发酵豆制品对小鼠血脂含量的影响(¯x±s,n=8)
从表4可以看出，各组小鼠的血脂含量均发生不同程度的变化。与对照组相比，模型组小鼠TG、TC、LDL-C水平极显著增加(P<0.01)，分别提高了72.16%、72.78%、169.05%，说明通过高脂饮食可以改变小鼠的血脂水平。与模型组相比，阳性对照组、纳豆各剂量组、豆豉各剂量组及豆酱各剂量组TG含量显著下降(P<0.05)；
阳性对照组、纳豆各剂量组、豆豉高剂量组、豆酱中、高剂量组TC含量显著下降(P<0.05)，豆豉低、中剂量组及豆酱低剂量组也有所下降但不显著(P>0.05)；
阳性对照组、纳豆各剂量组、豆豉低、高剂量组及豆酱各剂量组LDL-C含量显著下降(P<0.05)，豆豉中剂量组及豆酱低剂量组也有所下降，但不显著(P>0.05)。因此，高脂饮食可以使小鼠血脂水平增加并引起小鼠脂质含量异常，通过一定剂量膨化大豆发酵豆制品的干预，能够改善高血脂小鼠的血脂含量，与阳性对照组组相一致，且呈量效关系，降低发生病症的风险。
发酵豆制品富含多种降血脂功能成分，如纳豆激酶、GABA、异黄酮类物质等。谢嵩等[15]采用纳豆对高脂模型大鼠进行膳食干预，发现各剂量组能够显著降低血清中TC、TG的含量，表现出良好的降血脂功效。Yeap等[16]发现发酵绿豆富含GABA，并采用发酵绿豆、未发酵绿豆对高脂模型小鼠进行膳食干预，发现发酵绿豆降血脂及保护肝脏能力显著高于未发酵绿豆。张亮[17]采用大豆异黄酮对高脂模型大鼠进行膳食干预，发现各剂量组能显著降低血清中TC、TG、LDL-C、MDA含量，显著提高血清中SOD、GSH-PX、T-AOC水平。李晓玲[18]采用大豆异黄酮对蛋鸡进行膳食干预，发现各剂量组能显著降低血清和蛋黄中TC、TG、LDL-C、MDA的含量。膨化大豆发酵豆制品具有一定的降血脂功效，可能是由于多种活性物质的协同作用，从而改善血脂异常并起到一定预防高血脂症的功效。
2.4 膨化原料发酵豆制品对小鼠肝质量及肝脏指数的影响
脏器指数又称脏体比，是指试验动物某个脏器质量与其体重的比值。肝脏是机体内参与脂质代谢的重要器官。研究发现，高脂饮食会引起肝脏脂代谢紊乱，脂肪在肝脏过度堆积，导致肝脏重量发生改变，肝脏指数也随之变化，故肝脏指数可以反映各组小鼠肝脏的损伤程度[19]。膨化原料发酵豆制品对小鼠的肝质量及肝脏指数的影响如表5所示。
表5 膨化大豆原料发酵豆制品对小鼠肝质量及肝脏指数的影响(¯x±s,n=8)
从表5可以看出，各组小鼠的肝质量、肝脏指数发生不同程度的变化。与对照组相比，模型组小鼠肝质量、肝脏指数显著提高(P<0.05)，分别提高了30.52%、19.77%，表明通过高脂饮食改变了小鼠的肝脏质量、肝脏指数，影响了脂肪代谢情况。与模型组相比，阳性对照组、纳豆各剂量组、豆豉各剂量组及豆酱各剂量组肝质量显著下降(P<0.05)；
阳性对照组及各剂量组肝脏指数有所下降但不显著(P>0.05)。高脂饮食可以使小鼠肝脏质量占比增加并引起小鼠肝脏脂肪堆积，造成肝脏增生肥大。通过膳食干预，膨化大豆发酵豆制品可以降低小鼠肝脏内部的脂肪蓄积并加速体内脂质的转运、排泄，改善高脂饮食小鼠的肝重及肝脏指数。
2.5 膨化原料发酵豆制品对小鼠肝脏MDA和T-SOD水平的影响
高血脂症通常伴随着氧化应激和脂质过氧化，并引发机体抗氧化体系异常，从而加剧高血脂症进一步发展[20]。MDA是引发机体脂质过氧化作用的最终产物之一，对生物膜系统有破坏作用[21]。因此，MDA含量可以间接反映机体过氧化损伤程度。SOD是机体内重要的抗氧化酶之一，具有清除机体内自由基的功能，保护组织细胞免受伤害[22]。机体内SOD含量的高低可以反映机体的抗氧化能力。膨化原料发酵豆制品对小鼠肝脏中MDA、T-SOD含量的影响如表6所示。
表6 膨化大豆原料发酵豆制品对小鼠肝脏中MDA、T-SOD含量的影响(¯x±s,n=8)
由表6可知，各组小鼠肝脏中MDA和T-SOD含量发生不同程度的变化。与对照组相比，模型组小鼠MDA含量显著提高了95.98%、T-SOD含量显著下降了28.43%(P<0.05)，表明高脂饮食可以使机体内氧化系统发生改变，产生氧化应激反应。与模型组相比，阳性对照组、豆豉各剂量组、豆酱中、高剂量组MDA含量显著下降(P<0.05)，纳豆各剂量组及豆酱低剂量组也有所下降但不显著(P>0.05)；
阳性对照组、纳豆各剂量组、豆豉各剂量组及豆酱各剂量组T-SOD含量显著提高(P<0.05)。以上结果表明，一定剂量膨化大豆发酵豆制品可以降低由高脂饮食诱导的小鼠体内脂质过氧化产物的含量，并提高体内抗氧化酶活性，与阳性对照组组相一致，且呈量效关系。
血脂异常导致机体抗氧化能力下降，氧自由基的增多引起脂质过氧化从而加剧高血脂症。发酵豆制品富含多种抗氧化功能成分，如类黑精素、异黄酮类物质等。Mohd等[23]利用豆豉对肝脏损伤模型小鼠进行膳食干预，豆豉提取物能够显著降低TC、TG、MDA、AST、ALT含量，显著提高SOD含量，并发现小鼠肝细胞微泡脂肪变性减少。刘敏等[24]发现毛霉型豆豉、曲霉型豆豉中的类黑精素具有较强的抗氧化能力。Ahmad等[25]对未发酵和发酵大豆中异黄酮进行比较，发现经过发酵可以使异黄酮含量增加、抗氧化能力增强。膨化原料发酵豆制品的抗氧化作用可能是由于类黑精素和大豆异黄酮的协同作用减缓氧化应激，达到预防高血脂症并保护肝脏的作用。
血脂异常与氧化应激反应密切相关，氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)是LDL在大量活性氧的作用下发生过氧化反应的产物，最终产生MDA。OX-LDL也是形成泡沫细胞的主要因素，而泡沫细胞是血脂异常阶段具有特征性的细胞，MDA也会促进机体TC积累[26]，从而加剧高血脂症。
2.6 膨化原料发酵豆制品对小鼠肝脏组织病理变化的影响
各组小鼠肝脏组织切片如图1所示。对照组小鼠肝细胞排列紧密，肝窦清晰可见，未出现脂肪空泡、无脂肪变性和脂肪坏死等现象。模型组小鼠肝细胞排列松散无序，完整性较差，结构轮廓模糊，有大量脂肪空泡的出现，形态不完整。与模型组相比，阳性对照组及各试验组可不同程度改善小鼠肝脏细胞脂肪变性，脂肪滴空泡有所减少。结果表明，膨化原料发酵豆制品对小鼠脂肪肝变性程度具有改善作用。
图1 小鼠肝组织HE染色(100×)
本实验研究了3种膨化大豆发酵豆制品拮抗高血脂症功效，研究表明膨化大豆发酵豆制品均能不同程度改善高血脂症小鼠的血脂水平及肝脏损伤，降低小鼠体内脂质过氧化产物的含量，提高机体的抗氧化能力，达到拮抗高血脂的功效。膨化大豆发酵豆制品有一定的拮抗血脂异常作用，其机制有待进一步研究。
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