俞星雨 顾松 李云洁 乔梦媛 岑宇航
上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心普外科,上海 200127
肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)是儿童最常见的肝脏恶性肿瘤，占儿童恶性肿瘤总数的1%，常见于3岁以下患儿。作为胚胎源性肿瘤，HB由胚胎发生过程中出现恶性转化的肝细胞前体细胞产生。Wnt/β-catenin信号通路异常是肝母细胞瘤发生的主要原因，肝母细胞瘤也是人类癌症中CTNNB1(编码β-catenin的基因)突变率最高的肿瘤之一[1]。目前手术切除和以顺铂为基础的化疗是HB治疗的主要手段，但仍有20%的病例预后不良。因此，寻找合适的靶点对HB进行靶向治疗具有重大的研究意义。本文旨在叙述Wnt/β-catenin信号通路在肝母细胞瘤中的研究进展，并探讨Wnt/β-catenin信号通路在HB鉴别诊断、治疗和预后中的应用前景。
Wnt通路主要由四个部分组成，分别是细胞外的Wnt配体蛋白、细胞膜上的受体、胞浆内的信号转导部分和核内的转录调控部分，可分为依赖β-catenin的经典途径和不依赖β-catenin的非经典途径[2-3]。同时Wnt通路还可受其他分子的调控，与其他通路相互作用。在成熟的健康肝脏中，Wnt途径大多是无活性的，但在细胞更新、再生的过程中以及某些病理状况下可被重新激活[4]。
经典Wnt途径以β-catenin为核心分子，在调节细胞增殖、存活和分化中起重要作用。正常Wnt/β-catenin信号在成年肝组织中的失活是通过破坏复合物和拮抗剂的平衡调节来实现的。但在异常情况下，β-catenin无法被降解，从而在细胞质中积累，并转移到细胞核与转录因子结合，打开下游靶基因的转录，诱导细胞增殖，促进肿瘤的发生[5]。
经典的Wnt通路还可与其他分子和通路相互作用，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)可与Wnt相互作用，激活经典的Wnt/β-catenin信号通路[6]。而神经激肽-1受体(NK-1 receptor,NK-1R)的阻断则会抑制经典Wnt途径，HB细胞生长速度也随之下降，因此P物质(substance P,SP)/NK1R复合物是包括HB在内的多种肿瘤的抗癌靶点[7]。除此之外，核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等也被认为与Wnt/β-catenin信号通路存在相互作用[8]。这些通路和分子都为HB的靶向治疗提供了可能性。
非经典Wnt途径是β-catenin非依赖性的Wnt通路，它更多地与分化、细胞极性和迁移相关，因其依赖的核心分子不同而分为许多不同的种类，调控不同的生理过程。其中最典型的是细胞平面极性通路(Wnt/polarity通路)，它可在胚胎发育阶段调控细胞骨架重排，参与原肠胚的形成[9]。
以上经典和非经典通路并不是独立工作、互不打扰的，而是相互交叉、相互影响，在胚胎发育、干细胞生长、组织稳态等复杂过程中共同扮演重要角色。
大量研究已经证实，Wnt/β-catenin信号通路异常与HB的发生发展具有密切的关系。在正常肝组织中，Wnt/β-catenin信号通路一般处于非活性状态，仅在肝脏发育、细胞分化、内环境稳定和损伤修复等过程中发挥至关重要的作用。而基因突变、遗传表观修饰的异常以及部分蛋白、分子的异常表达都会导致Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，进一步影响HB的发生发展。
(一)Wnt/β-catenin信号通路相关基因的突变
CTNNB1基因突变是Wnt/β-catenin信号通路异常的常见原因。该基因编码β-catenin蛋白，其外显子3的框内缺失或错义突变会阻止β-catenin的磷酸化，进而阻碍其降解，导致β-catenin在细胞质和细胞核中聚积[10]。细胞核中积累的β-catenin与T细胞因子/淋巴样增强因子(T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor,TCF/LEF)家族的转录因子结合，招募共激活因子打开下游靶基因的转录，诱导细胞增殖，促进肝母细胞瘤的发生[5]。根据Stefania等[11]的研究，CTNNB1在不同HB亚型中的突变存在差异。在纯胎儿型HB中为CTNNB1的大缺失，包括第3和第4外显子的一部分，而在胚胎型HB中则局限于第3外显子的点突变。整体而言，60%～80%的HB可发生CTNNB1突变。
(二)遗传表观修饰异常
遗传表观修饰的异常是导致Wnt/β-catenin信号通路异常激活的重要原因。近年来表观遗传调节(包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、RNA甲基化等修饰)作为癌症治疗的新靶点受到关注。在HB中，甲基化修饰的异常已得到广泛研究，而组蛋白乙酰化修饰的相关研究仍较为缺乏。
目前研究发现，HB中的基因显示出整体低甲基化，伴有特定肿瘤抑制基因 (specific tumor suppressor genes,TSGs) 的高甲基化[12]。例如APC基因在HB中由于DNA的高甲基化失去功能，因此β-catenin无法与APC蛋白结合而降解，过量的β-catenin蛋白在细胞核聚积，进而通过Wnt/β-catenin信号通路促进HB的发生发展[13]。Carrillo-Reixach等[14]的研究通过不同程度的DNA低甲基化和CpG岛高甲基化鉴定出2个表观基因组簇(Epi-CA、Epi-CB)，定义了第一个HB分子风险分层(molecular risk stratification of HB,MRS-HB)，改进了目前的临床风险分层方法。
RNA编辑的失调也是HB发生发展的重要原因，例如信使RNA中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰的异常。经m6A-seq分析可得，与Wnt/β-catenin信号通路相关的基因CTNNB1、CCND1和NKD1中m6A甲基化增加。研究认为HB中高表达的甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)通过调节m6A修饰激活CTNNB1，使Wnt/β-catenin信号升高，促进肿瘤发展[15]。
(三)Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白、分子的异常表达
癌蛋白Myc是公认的Wnt/β-catenin信号通路的直接靶标之一，在超过80%的HB患者中都能检测到强c-Myc免疫反应性[10]。使用n-Myc抑制剂可引起HB细胞纺锤体紊乱和(或)凋亡，这为靶向治疗提供了可能[16]。
转录因子YAP是Hippo通路的主要下游效应分子，与β-catenin协同诱导HB形成[17]。根据核定位发现YAP在大约80%的人类HB样本中被激活，YAP/TAZ的活化上调可促进HB的形成[16,18]。而NFE2L2/NRF2转录因子的突变或过表达可加速由Wnt/β-catenin和Hippo通路突变产生的肝母细胞瘤的生长，以及肿瘤相关的囊肿和坏死[19]。这也为HB更精细的分类和治疗设计提供了依据。
大脑表达的X连锁蛋白1(brain-expressed X-linked protein 1,BEX1)与人类 runt相关转录因子3(human runt-related transcription factor 3,RUNX3)建立相互作用来阻断其对β-catenin转录的抑制，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，并在HB中维持干性[20]。因此，BEX1可以成为HB有价值的治疗靶点。
(一)Wnt/β-catenin信号通路与HB鉴别诊断
目前，HB主要依靠影像学和病理学检查进行诊断，其中甲胎蛋白是最常使用的指标，也可联合β-catenin、胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)等生物标志物以及部分miRNAs的表达水平帮助明确诊断。
β-catenin是鉴别肝母细胞瘤亚型的重要依据之一。肝母细胞瘤根据组织病理学特征分为上皮型和混合上皮间质亚型，定义为C1和C2[21]。在这两种亚型中，β-catenin突变率相似，但定位有差异，在C1型肿瘤中靠近质膜，而在C2型中主要位于细胞核[22]。
Huang等[23]对18个未处理的HB样本和22个新辅助化疗后的HB样本进行检测，发现 Wnt/β-catenin信号通路的下游靶标谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)可作为新型免疫组织化学标记物用于肝脏肿瘤的鉴别诊断，是肝脏肿瘤中Wnt/β-catenin信号通路活化的标志。HB中常见核β-catenin染色和弥漫性GS染色，该方法对化疗后残留的肿瘤细胞鉴定效果更好[23]。
(二)Wnt/β-catenin信号通路与HB靶向治疗
针对Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂大致可分为生物抑制剂(单克隆抗体和重组核酸)和小分子化合物(常规药物和新型药物)两类。生物抑制剂包括抗Wnt抗体、β-catenin siRNA等。使用抗Wnt抗体可诱导过表达Wnt-1的肿瘤细胞凋亡，抑制小鼠肿瘤生成，具有特异性和选择性[24]。而β-catenin siRNA可以特异性抑制β-catenin的表达，降低β-catenin的下游信号活性。一些miRNA也可通过抑制β-catenin表达来灭活Wnt/β-catenin信号通路，延长G0/G1期并缩短S期，抑制体外肿瘤细胞的增殖[25]。
乳腺癌雌激素调控基因1(growth regulating estrogen receptor binding 1,GREB1)被发现可以作为Wnt/β-catenin信号通路的靶基因，对HB的发生发展具有重要意义，可能成为治疗HB的分子靶点[26]。GREB1作为核蛋白，可针对性使用核酸来抑制。GREB1反义寡核苷酸(GREB 1 antisense oligonucleotides,GREB1 ASOs)抑制GREB1合成，在小鼠模型中可抑制HB样肿瘤生成，可以作为HB靶向治疗的候选药物。
具有Wnt/β-catenin信号通路抑制作用的化合物有塞来昔布、伊马替尼和黄酮类药物等。塞来昔布可将β-catenin释放到细胞质，并靶向糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK -3)磷酸化，同时损害酪氨酸激酶受体的自磷酸化，导致Wnt/β-catenin信号传导受抑制[27]。伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，可间接抑制β-catenin酪氨酸磷酸化[24]。而对于黄酮类药物，研究证明天然存在的类黄酮表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)可诱导肿瘤抑制因子SFRP1重新表达，并下调Wnt靶基因从而抑制Wnt/β-catenin信号传导[28]。
目前来看，HB的靶向治疗大多停留在实验室研究阶段，需要进一步探索。而作为较为明确的HB形成机制，Wnt/β-catenin信号通路可作为靶向治疗的重点研究方向。
(三)Wnt/β-catenin信号通路与HB预后
目前已知甲胎蛋白表达水平与HB预后、治疗和复发有一定的相关性[29]。关于Wnt/β-catenin信号通路对HB临床预后意义的实验研究较为缺乏，但已有研究表明β-catenin的表达及细胞核定位对HB预后具有一定的预测意义，其在两种HB亚型中的定位差异导致了下游不同靶标的激活，从而影响两种不同亚型HB的预后[30]。
综上所述，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活会导致β-catenin在细胞核中蓄积，从而促进细胞增殖，这一现象是HB的主要标志。Wnt/β-catenin信号通路中相关基因的突变、表观修饰的改变以及相关蛋白、分子的异常表达可影响HB的发生发展。目前已有针对Wnt/β-catenin信号通路及其相关通路中一些靶点的HB治疗药物，并在细胞水平或动物模型中进行了研究，但尚未在HB临床治疗中推广应用。Wnt/β-catenin信号通路在HB临床预后中的作用还有待进一步研究。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明文献检索为俞星雨、乔梦媛、李云洁、岑宇航，观点梳理为俞星雨，论文撰写为俞星雨、乔梦媛、李云洁、岑宇航，论文审校为顾松
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