郭慧莲，郑圣坤，陈志颖，黄绍梅
1.广州市胸科医院儿科住院部，广东广州 510095；
2.广州市胸科医院检验科，广东广州 510095
结核病是严重危害全球儿童健康的传染病，2021 年世界卫生组织（World Health Organization,WHO）全球结核病报告，估算2020 年全球新发结核病例990 万，其中约109 万儿童，约20 万儿童死亡[1-2]。研究表明，结核性脑膜炎（tuberculous meningitis, TBM）是儿童结核病死亡的重要原因[3]。结核分枝杆菌主要存在于感染者肉芽肿巨噬细胞中，细胞介导免疫的活化巨噬细胞吞噬、灭杀结核菌，CD4+细胞在该免疫过程中具有重要作用[4]。TBM的发生及预后与T 淋巴细胞功能息息相关[5]。针对结核菌侵入人体产生的细胞免疫反应，临床常用细胞免疫诊断方法有结核菌素皮肤试验（tuberculin skin testing, TST）及γ-干扰素释放试验（interferon gamma release assays, IGRAs）[6-7]。当前，少 有研究比较TBM 患儿血IGRAs、TST 情况。本研究拟比较广州市胸科医院2018 年1 月—2021 年10 月共51 例外周血CD4+细胞数正常的TBM 患儿IGRAs 及TST阳性率，协助了解患儿细胞免疫反应。现报道如下。
1.1 一般资料
选取于本院住院诊断为TBM 的51 例患者为研究对象，其中男27 例，女24 例；
年龄2 个月～14 岁；
其中婴儿4 例，幼儿7 例，学龄前11 例，学龄期29例。根据TBM 的改良的英国医学研究委员会分期标准（British Medical Research Council， MRC）其中格拉斯哥昏迷评分（Glasgow Coma Scale, GCS）15 分且无局灶性神经损伤（MRC Ⅰ期）36 例，GCS 11～14分或GCS 为15 分伴局灶神经损伤表现（MRC Ⅱ期）11 例，GCS≤10 分（MRC Ⅲ期）4 例。研究对象监护人均已签署知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会同意。
1.2 纳入与排除标准
根据TBM 评分系统，头颅MRI 检查结果，评分≥12 分的患儿，以及有TBM 临床表现，CT、MRI 或彩超提示存在头颅以外其他部位结核依据并且痰、胃液、肺泡灌洗液、淋巴结、大小便、血清抗酸染色、结核分枝杆菌核酸或结核分枝杆菌培养阳性者，并符合以下任何一项的患儿：①脑脊液抗酸染色阳性；
②脑脊液结核分枝杆菌培养阳性；
③脑脊液中结核分枝杆菌核酸检测阳性；
④脑或脊髓组织病理学检查符合结核病病理学改变，且抗酸染色阳性或病理分子生物学为结核分枝杆菌复合群。排除标准：①反复住院的同一患儿；
②未同时进行两项检测方法患儿；
③HIV 阳性；
④先天免疫缺陷病患儿；
⑤长期使用糖皮质激素等免疫抑制剂患儿；
⑥无卡介苗接种史患儿[8-9]。
1.3 方法
IGRAs：严格遵守实验操作规范，抽取患儿静脉血3～6 mL，使用酶联免疫法的试剂盒，在空白对照管（N）、结核抗原管（T）及阳性对照管（M）中各加入受检血液1 mL 后立刻充分振摇10 次，采血16 h 内37℃进行孵育，孵育结束后离心收集血浆，血浆放置在2～8℃，12 h 内行酶联免疫吸附试验，将实验结果录入QFT 分析软件进行计算来确定每个检测血浆样本中γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)浓度。
TST：吸取5 IU 结核菌素纯蛋白衍化物在患儿左前臂掌侧中下1/3 进行皮内注射，至出现6～10 mm 圆皮丘，皮试后禁止抓挠及摩擦注射部位，72 h 后观察皮肤反应情况，以测量硬结的纵横径来记录反应范围，取两者平均值来判断反应强度。
1.4 观察指标
IGRAs 结 果 判 定：①当N≤8.0 IU/mL，T-N≥0.35 IU/mL 和≥25%N，M-N 任何值，结果为阳性，提示可能存在结核感染T 细胞免疫反应；
②当N≤8.0 IU/mL，T-N≥0.35 IU/mL 和＜25%N，M-N≥0.5，结果为阴性，提示可能不存在结核感染的T 细胞免疫 反 应；
③当N≤8.0 IU/mL，T-N≥0.35 IU/mL 和＜25%N 或T-N＜0.35，M-N＜0.5，以及当N＞8.0，T-N 及M-N 为任何值结果均为不确定，代表不能确定是否存在结核感染的T 细胞免疫反应。
TST 结果判读：①（横径+纵径）/2≥5 mm 或皮试部位周围出现双圈、水泡、坏死、淋巴管炎为阳性，提示存在结核分枝杆菌感染或接种过卡介苗；
②（横径+纵径）/2＜5 mm 为阴性，除外重症结核、免疫缺陷性疾病、长期使用免疫抑制剂等因素所致假阴性，提示可能不存在结核分枝杆菌感染。
1.5 统计方法
采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计数资料采用频数和百分比（%）表示。
IGRAs 阴性5 例，占比9.8%，阳性46 例，占比90.2%，TST 阴性30 例，占比58.8%，阳性21 例，占比41.2%。
TBM 是最严重的一种肺外结核，儿童发病率较成人高，病死率高，存活者易遗留神经后遗症[10]。TBM 主要通过血行播散引起，CD4+T 淋巴细胞亚群在结核分枝杆菌的免疫中发挥非常重要的作用。活化的CD4+T 淋巴细胞通过分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IFN-γ 并激活巨噬细胞等方式遏制结核分枝杆菌的扩散[4]。临床上最常用于诊断结核感染的IGRAs 与TST 也需要CD4+T淋巴细胞功能正常。关于CD4+T 淋巴细胞与儿童TBM，目前多数研究主要集中在儿童TBM 的CD4+T淋巴细胞数的变化，但临床上部分TBM 患儿CD4+T淋巴细胞数正常范围，本研究通过对比CD4+T 淋巴细胞数正常的TBM 患儿IGRAs 与TST 的阳性率，发现TBM 患儿IGRAs 阳性率显著高于TST，IGRAs 阴性患儿的TST 均阴性。
结核分枝杆菌感染机体后，释放出结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶（early secretary antigenic target,ESAT-6）、培养滤液蛋白10（10-kDa culture filtrate protein, CFP-10）等特异性抗原，被加工呈递给特异性T 淋巴细胞形成特异的记忆T 细胞。IGRAs 检测该特异性T 淋巴细胞再次遇到结核抗原刺激时释放的IFN-γ 数值[6]。而TST 是皮下注射结核杆菌相关抗原，使得致敏的淋巴细胞释放可溶性淋巴因子，增加了血管壁通透性，同时巨噬细胞在局部皮肤聚集、浸润，最终检测局部形成红肿硬结大小及是否水泡等反应。从原理上可知,两种检测方法的阳性结果均能反映机体抗结核的细胞免疫状态。在本研究中，TBM 患儿IGRAs 阳性占比90.2%，TST阳性占比41.2%，这提示CD4+淋巴细胞数正常的情况下IGRAs 更能显示出机体抗结核的细胞免疫状态。
排除CD 细胞数影响的情况，多项研究发现TBM 患者IGRAs 阳性率高于TST[2,12-14]，这可能是由于TST 不仅要求致敏CD4+细胞免疫功能正常，同时需要其有效地找到注射部位[10]。如薛红超[11]、朱海妹等[12]研究发现在肺结核病、结核病中IGRAs 的阳性率分别为90.7%、90.4%，TST 的阳性率分别为47.02%、76.7%，而张春艳等[13]对比非TBM 患者发现TBM 患者的IGRAs 阳性率为90.2%，PPD 的阳性率为64.5%，母发光等[14]亦研究发现TBM 患儿IGRAs阳性率为87.50%，而PPD 阳性率仅为56.25%，这与本研究中患儿的IGRAs 阳性率90.2%、TST 阳性率41.2%的结果相符。
临床上，TBM 患者多存在细胞免疫功能抑制的状态，主要包括CD4+细胞数降低及其功能异常[15]。贺莹等[16]发现外周血CD4+细胞低于正常健康者，同时杨硕等[17]研究亦发现结核组CD4+细胞显著低于健康对照组，其中包括TBM 在内的肺外组比肺内组明显，且年龄越小越明显，而经有效抗结核治疗后外周血CD4+细胞显著升高[18]。在CD4淋巴细胞减少的结核病患者中，IGRAs 比，TST 仍更能检测到结核感染后的特异性免疫反应[19]。同时，研究表明TST 较IGRAs 更易受CD4+淋巴细胞数的影响[20]。本研究结果提示IGRAs 较TST 更有能力检测到结核细胞免疫反应，故对于IGRAs 阴性的TBM 患儿，可能需要考虑到存在细胞免疫功能受损的情况。
综上所述，IGRAs 在反映结核细胞免疫反应方面更有优势。IGRAs 阴性的TBM 患儿更倾向于存在细胞免疫功能受损的可能，可结合临床情况选择合适的提高细胞免疫功能的治疗。
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