孔德明，陈 超，周启动，刘则华，郭鹏然*
（1.广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测重点实验室，广东 广州 510070；
2.华南理工大学 环境与能源学院，广东 广州 510006）
环境内分泌干扰物因可能对人体健康造成危害成为关注的焦点［1－2］。根据产生途径，环境内分泌干扰物主要包括天然雌激素、雄激素、植物雌激素、霉菌类雌激素，以及各种工业化学物质［1］，其中外源性摄入的天然雌激素因同样具有较强的雌激素生物活性而受到重视。牛奶由于其营养价值丰富且容易消化吸收而广泛出现在世界各国人的食谱中［3－4］，然而牛奶也是人体外源性天然雌激素的重要摄入来源［5－6］，据联合国粮农组织统计，全球每年牛奶的消费量将近7×108吨［7］，因此人体通过牛奶摄入天然雌激素的风险绝对不容忽视。目前牛奶中天然雌激素的研究通常是针对4种常见天然雌激素［8］，即雌酮（E1）、17α-雌二醇（17α-E2）、17β-雌二醇（E2）和雌三醇（E3），而其它天然雌激素的研究鲜有报道［3，5，8－11］。
目前国内外牛奶中雌激素的检测方法主要有免疫检测法和质谱法［1，12］。免疫检测法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）［6，9］和放射性免疫测定（RIA）［13］，质谱法则主要采用液液萃取［8，14－15］、固相萃取［10，16－21］、磁性固相萃取［22－23］和固相微萃取［24－25］等前处理技术，结合气相色谱－三重四极杆质谱（GC－MS/MS）［16］和液相色谱－三重四极杆质谱（LC－MS/MS）［21］进行检测。Malekinejad等［8］利用液液萃取结合LC－MS/MS测定牛奶中的天然雌激素，在仅考察4种常见天然雌激素（E1、E2、E3、17α-E2）情况下，评估出人体通过牛奶摄入的天然雌激素每人每天平均可达372 ng，可见牛奶是人体外源性天然雌激素的主要暴露来源之一。研究还发现，天然雌激素E1、E2可代谢转化为16α-羟基雌酮（16αOHE1）和16keto雌二醇（16ketoE2），其中16ketoE2的雌激素效应与最高的E2相当［26－29］。为更全面评估牛奶的安全性，本研究建立了一种GC－MS同时测定牛奶样品中E1、E2、17α-E2、E3、16αOHE1、16ketoE2 6种天然雌激素的方法，并将其应用于实际样品的测定，满足了牛奶中天然雌激素的检测和质量控制需求。
1.1 仪器与试剂
7890A/5975C气相色谱－串联质谱仪（美国安捷伦公司）；
BSA224S－CW电子分析天平（德国赛多利斯）；
TDL－40B离心机（上海安亭科学仪器厂）；
BF－2000F氮吹仪（北京八方世纪科技有限公司）；
Vortex－2涡旋仪（上海沪析实业有限公司）；
P100N移液器（法国Eppendorf公司）；
24位型负压固相萃取装置（深圳逗点生物技术有限公司）；
DHG－9075A恒温干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
OASIS HLB Cartridge固相萃取柱（225 mg，美国Waters公司）。
标准物质：E1、E2、17α-E2、E3、16αOHE1、16ketoE2（纯度均大于98%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；
内标：17β-E2-D4（E2-D4，纯度大于98%，天津阿尔塔科技有限公司）；
双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA） + 1% 三甲基氯硅烷（TMCS，Regis Technologies）；
N，N-二甲基甲酰胺（DMF，上海安普科技股份有限公司）；
乙酸乙酯、乙腈、甲醇（色谱级，Sigma公司）；
磷酸氢二钾（分析纯，广州化学试剂厂）；
牛奶（超高温瞬时灭菌牛奶，保质期内）购于广州当地的超市，于−20 ℃保存。实验用水均为超纯水。
1.2 标准溶液的配制
雌激素混合标准储备液：准确称取10 mg的6种雌激素标准品于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成1 g/L的标准储备液，于−20 ℃保存。
中间标准溶液：用甲醇将上述标准储备液稀释成1 µg/mL的中间标准溶液，于−20 ℃保存。
标准工作液：6种雌激素的质量浓度梯度为5、10、20、40、80、100 µg/L；
其中均加入50 ng的17β-E2-D4内标，定容至1 mL。
1.3 样品前处理
提取：量取10 mL牛奶样品于50 mL离心管中，加入50 ng内标，10 mL乙腈萃取振荡15 min后，加入6 g磷酸氢二钾粉末，依次涡旋1 min，4 000 r/min离心10 min后，收集上清液。
富集净化：将上清液转移至500 mL烧杯中，用水稀释至500 mL；
固相萃取柱经过5 mL乙酸乙酯、5 mL甲醇、10 mL水活化后，将上述稀释的上清液在流速10 mL/min下通过固相萃取柱富集；
然后依次用5 mL 10%甲醇、5 mL水、5 mL甲醇－水－氨水（10∶88∶2，体积比）清洗净化；
负压下抽干固相萃取柱后，依次使用8 mL甲醇－乙酸乙酯（8∶2）和2 mL乙酸乙酯洗脱目标物。
衍生化：收集洗脱液，氮吹至干后，加入100 µL DMF复溶，加入100 µL BSTFA + 1% TMCS衍生化试剂80 ℃下反应60 min后［28］，用乙酸乙酯定容至1 mL，待上机测定。
1.4 色谱－质谱条件
安捷伦HP－5MS色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm）；
升温程序：初始温度为100 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，8 ℃/min升至260 ℃，3 ℃/min升至300 ℃，并保持2 min；
进样量：3 µL；
进样口温度：280 ℃；
辅助加热区：280 ℃；
载气：氦气（纯度 > 99.999%）；
恒流模式；
进样方式：不分流进样；
流速：0.85 mL/min。
离子源温度：230 ℃；
四极杆温度：150 ℃；
检测方式：选择离子模式（SIM）；
电离能量：70 eV；
其他参数见表1。
表1 6种天然雌激素的分析参数Table 1 Analytical parameters of six natural estrogen compounds
2.1 色谱－质谱条件的优化
由于雌激素类物质的衍生物极性弱，因此实验采用固定相为5%苯基－甲基聚硅氧烷的弱极性石英毛细管柱进行分离。采用200 µg/L混合标准溶液考察了色谱条件。在优化后色谱条件（见“1.4”）下，目标峰与其它干扰峰完全分开，满足定性定量要求。为了提高分析灵敏度，实验采用选择离子（SIM）模式，选择3个特征离子，其中1个定量离子，2个定性离子（见表1）。
2.2 提取溶剂的选择
根据6种雌激素在弱极性或中等极性的有机溶剂中有较高的溶解性，考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈和含20%乙酸乙酯的乙腈4种提取溶剂对6种待测物的加标回收率（见图1）。结果显示，采用甲醇提取时，加标回收率最低；
采用乙酸乙酯和含20%乙酸乙酯的乙腈提取时，乙酸乙酯带入了更多的非极性脂质类物质，提高了基质效应，导致整体回收率偏高。因此实验选择乙腈作为最佳提取溶剂。
图1 提取溶剂对牛奶中6种雌激素提取效率的影响（n = 3）Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction recoveries of six estrogens from milk（n = 3）
2.3 提取溶剂体积的优化
以乙腈为提取溶剂，考察了5、10、15、20 mL不同提取溶剂体积对目标物提取效率的影响。结果显示，选用10 mL提取溶剂时6种目标物均有较好的回收率（图2）。当提取溶剂体积降低为5 mL时，样品与提取溶剂的接触面减少，从而影响两相传质效果，导致提取效率偏低；
当提取溶剂增加为15、20 mL时，由于两相浓度分配早已达平衡等原因，提取效率未进一步提升。考虑试剂消耗，选择提取溶剂的最佳体积为10 mL。
图2 提取溶剂体积对牛奶中6种雌激素提取效率的影响（n = 3）Fig.2 Effect of extraction volume on extraction recoveries of six estrogens from milk（n = 3）
2.4 线性范围、检出限与定量下限
采用本方法测定“1.2”中配制6种目标化合物的标准工作溶液，内标法定量。结果表明（表2），6种雌激素在5 ~ 100 µg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）大于0.995。采用空白牛奶样品中添加目标物的方法，以3倍信噪比（S/N）对应的质量浓度为方法检出限（LOD），10倍信噪比（S/N）对应的质量浓度为方法定量下限（LOQ），方法检出限和定量下限分别为0.17 ~ 0.51 µg/L和0.56 ~ 1.68 µg/L。
表2 6种天然雌激素的线性方程、线性范围、检出限及定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients（r2），LODs and LOQs of six estrogen compounds
2.5 回收率与相对标准偏差
为验证方法的准确性和重复性，分别在牛奶样品中加入低、中、高4个不同质量浓度水平（5、10、20、50 µg/L）的标准溶液及内标，按照“1.3”进行样品前处理，每个浓度水平设置9个样品，计算每个样品的回收率和相对标准偏差（RSD）。由表3可知，在4个加标水平中，6种目标物的回收率为83.1% ~ 119%，RSD为2.1% ~ 15%，表明该方法的准确性和精密度符合方法学要求。
表3 6种天然雌激素的回收率及相对标准偏差（n = 9）Table 3 Spiked recoveries and relative deviations of six natural estrogen compounds（n = 9）
2.6 实际样品的测定
采用本方法对市场上销售的3款牛奶进行测定（表4）。检测结果显示，除了E3，其他5种雌激素均能在牛奶中检出，其中E1的检出量为0.91 ~0.99 µg/L；
16αOHE1的检出量为0.22 ~ 0.29 µg/L；
17α-E2仅在1号样中检出，检出量为0.20 µg/L；
E2检出量为3.27 ~ 3.33 µg/L；
16ketoE2在3个样品中均检出，检出量为0.38 ~ 2.16 µg/L，阳性样品的检测谱图如图3所示。
图3 阳性样品中5种雌激素的总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of five estrogens in positive samples
表4 牛奶中6种天然雌激素的检测结果Table 4 Detection results of six natural estrogens in milk ρ/（µg·L−1）
本研究成功建立了气相色谱－串联质谱同时测定牛奶中6种天然雌激素的方法。该方法具有灵敏度高、精密度好的优点，适合用于牛奶及其制品中天然雌激素含量的测定，可为牛奶质量控制提供参考。
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