年 梦，赵泽丰，吕 红，王晨冉，杨晓航*，乔海法，李 斌，白育军，吴少平，郑晓晖
1.陕西中医药大学，陕西省针药结合重点实验室，咸阳 712046；
2.西北大学生命科学学院，西安 710069
图1 TMCA的结构
ZHAO Z等[4]报道，TMCA，TMCA甲酯(A01)及对甲氧基肉桂酸被鉴定为大鼠口服远志后主要的代谢产物。其中化合物A01(见图2)能对家兔心肌快反应动作电位(AP)和L型钙通道产生较大影响。15～30 μmol·L-1剂量下的TMCA甲酯在离体兔心室肌细胞中可以剂量依赖性缩短动作电位时程50%～90%，并且能够抑制L型钙通道。此外，化合物A01能够对抗异丙肾上腺素及L型钙通道开放剂BayK8644所致的早期去极化(EADs)与延迟去极化(DADs)，降低细胞兴奋性(TAs)。TMCA甲酯能够通过钙拮抗抑制钠电流，起到抗心律不齐作用。化合物A01还被报道具有阿魏酸酯酶(FAE-Ⅲ)抑制活性，采用Wilkinson法测定得到阿魏酸酯酶的反应速度达到最大速率的1/2时底物浓度(Km)为1.63，饱和状态下任何酶催化反应的极限速率(Kcat)为1 063[5]。
CHIN Y W等[6]从马达加斯加的一种古柯属(Erythroxylumpervillei)药用植物的茎干中分离得到2种包含TMCA酯结构的古柯碱，并对其进行了影响胆碱能及肾上腺素活性测定。在30 μmol·L-1剂量下，Pervilleine A(A02)在天竺鼠回肠模型中对胆碱能表现出非竞争性抑制，且不影响卡巴胆碱所致的离体大鼠肛尾平滑肌收缩。在100 μmol·L-1剂量下，化合物A02可拮抗肾上腺素诱发的大鼠主动脉环收缩，而对大鼠血管收缩无影响。另一种与A02结构相近的古柯碱Pervilleine H(A03)则在上述实验中未表现出抗胆碱能及抗肾上腺素能的活性。该课题组在后续工作[7]中又从此种植物中分离得到古柯碱多取代酯类化合物，并根据先前的构效关系对分离化合物的活性进行了预测。
此外，萝芙木属(Rauvolfia)中的利血胺(Rescinnamine，A04)也包含TMCA酯结构，此化合物与来源于萝芙木中的降压药物利血平结构相近，作为一种血管紧张素转化酶抑制剂，该化合物表现出较强的降压活性[8]。
对酯类化合物的合成，一般使用偶联试剂催化肉桂酸与醇类反应，常用的偶联试剂包括二甲基氨基吡啶/4-二甲基氨基吡啶(dicyclohexylcarbodiimide/4-dimethylaminopyridine,DCC/DMAP)，4-二甲基氨基吡啶/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide,DMAP/EDCI)等；
或将酯转化为酰氯后与醇反应，对于糖苷上醇的酯化，有文献报道采用光延反应的催化剂三苯基膦/偶氮二羧酸二异丙酯(triphenylphosphine/diisopropyl azodicarboxylate, PPh3/DIAD)来实现。而肉桂酸的获得多采用市售，最为广泛的肉桂酸合成反应为珀金(Perkin)反应，一般由芳香醛与酸酐作为底物(见图3)，也有采用相应的醛与丙二酸在哌啶催化下进行克脑文盖尔(Knoevenagel)缩合反应制备混旋肉桂酸(见图4)。值得一提的是，采用3,4,5-三甲氧基苯甲醛与丙二酸制备而成的TMCA属于以反式为主的混旋肉桂酸，而目前TMCA的顺反异构对其活性的影响则鲜见报道。
图3 Perkin反应合成TMCA
图4 Knoevenagel反应合成TMCA
2.1 抗肿瘤活性
抗癌药物的研发一直是学术界关注的热点，TMCA作为活性基团在抗癌先导化合物的筛选中扮演了重要的角色，其抗肿瘤活性涉及的靶点包括P-糖蛋白(P-gp)、2型甲硫氨酸氨肽酶(MetAP-2)等。BUSNENA B A等[9]采用偶联试剂偶氮二羧酸二异丙酯/磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate, DIAD/TPP)催化合成了包含化合物B01(见图5)在内的一系列衍生物，并对其进行了抗肿瘤活性测定，发现对于人乳腺癌细胞株MDA-MB231的生长具有一定抑制活性，创伤修复法(wound-healing, WHA)测定得该化合物的半数抑制浓度(IC50)为46.7 μmol·L-1，而溴化噻唑蓝四氮唑[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, MTT]法测定得该化合物的IC50则大于100 μmol·L-1。
图5 具有抗肿瘤活性的TMCA酯类衍生物
JIAN Y等[10]将槲皮素的裸露羟基全部甲基化后在3位上通过乙二醇一侧与黄酮成醚，另一侧酯化合成一系列酯类化合物。其中化合物B02具有显著的抑制细胞膜 P-gp介导的药物外流所致的肿瘤多药耐药(MDR)活性。化合物A02在LCC6MDR细胞株中与紫杉醇联用的IC50为24.2 nmol·L-1，逆转倍数为6.0(IC50单用抗肿瘤药/IC50联用待测化合物)；
HEK293/R2细胞株中与拓扑替康联用的IC50为34.7 nmol·L-1，逆转倍数为14.0；
MCF7-MX100细胞株中与拓扑替康联用的IC50为4.1 nmol·L-1，逆转倍数为9.1。值得注意的是，单独使用该化合物对上述细胞株均无生长抑制活性(IC50>100 μmol·L-1)。
TEODORI E等[11]合成了一系列的环己二酯肉桂酸衍生物，并评估了其抗多药耐药活性。其中拆分得到的反/顺式(trans/cis)化合物B03的活性最强。其多药耐药性浓度为0.5 μmol·L-1时半数最大增加的抑制剂浓度为0.01 μmol·L-1。
XU C C等[12]将二氢青蒿素裸露的羟基与多种肉桂酸与苯丙酸酯化合成了一系列衍生物。其中化合物B04表现出显著的抗肿瘤活性。在体外模型中，化合物B04对肿瘤细胞株PC-3、SGC-7901、A549及MDA-MB-435s增殖抑制的IC50分别为17.22、11.82、0.50、5.33 μmol·L-1。而化合物5对于正常人体干细胞的细胞毒性为58.65 μmol·L-1，其数值为对肝癌细胞株A549细胞毒性的117.3倍。
NAM N H等[13]将过量肉桂酸与4位氯代的香豆素在三乙胺催化下合成一系列衍生物。其中化合物B05表现出一定的抗肿瘤活性，其对B16小鼠黑色素瘤细胞及HCT116人结肠癌细胞的IC50分别为6.74、8.3 μg·mL-1。
LEE K等[14]合成了一系列紫花前胡素肉桂酸酯衍生物，化合物B06表现出一定抗肿瘤活性。在100 μmol·L-1剂量下，化合物B06对B16F10小鼠黑色素瘤细胞增殖产生了18.8%的抑制率，其细胞毒性为4.1%，在所有肉桂酸酯类衍生物中相较于其他化合物活性较弱。
HAN C K等[15]采用同源建模方法建出MetAP-2结构，烟曲霉素是一种可通过抑制血管生成起到抗肿瘤作用的化合物，故采用烟曲霉素衍生物作为配体并对其进行合成，对配体与受体作用进行模拟对接评估，并测定烟曲霉素衍生物的抗肿瘤活性。在所有衍生物中，化合物B07表现出了最佳的抗肿瘤活性，其在淋巴瘤细胞EL-4、小牛肺动脉内皮细胞CPAE及小鼠白血病细胞P388D1中的IC50分别为0.000 15、0.000 03>1 ng·mL-1。FARDIS M等[16]将B07的MetAP-2抑制活性进行了测定，其IC50为0.96 nmol·L-1。该化合物抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖的半数有效浓度(EC50)为2.6 nmol·L-1。
WEI B L等[17]设计并合成出一系列查尔酮肉桂酸酯衍生物并对其抗肿瘤活性进行了测定。化合物B08表现出一定的抗肿瘤活性，其在A549、Hep 3B、HT-29与MCF-7 4种细胞株中的IC50分别为36.7、23.2、23.8、6.4 μmol·L-1。进一步研究表明，该类衍生物能将肿瘤细胞周期阻滞在G2/M期(G2期是细胞快速增长期以及有丝分裂期之前的蛋白质合成期，M期是细胞生长停止以及有序地进行有丝分裂期)，从而起到抗肿瘤作用。
根据胡椒中分离的天然产物，HU L H等[18]设计合成了一系列肉桂酸酯衍生物。其中化合物B09在多种细胞株中表现出一定的抗肿瘤活性，其对于PC-3、Hela、A549及BEL7404细胞株的IC50分别为80、64、172、212 μmol·L-1。
2.2 抗病毒活性
引入TMCA对于天然产物的结构修饰提供了新思路，近年来许多研究证明TMCA酯类衍生物具有抗病毒活性。LIU S等[19]合成了16个苯丙酸类衍生物，并测定了其抗乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)活性。化合物C01(见图6)对于HepG2 2.2.15细胞株的半中毒剂量(CC50)为463.07 μmol·L-1，对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的IC50为50.45 μmol·L-1；
对乙肝e抗原(HBeAg)的IC50为50.11 μmol·L-1；
对乙肝脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)复制的IC50为51.80 μmol·L-1，在所有待测化合物中表现出最好的抗病毒活性，且选择性指数(SI=CC50/IC50)最高。
图6 具有抗病毒活性的TMCA酯类衍生物
WANG L J等[20]前期从白首乌(Cynanchumbungei)中分离得到四环三萜类化合物，经过测定其活性得到了抗乙肝病毒活性单体告达亭(caudatin)，进而对告达亭进行结构修饰，合成了一系列肉桂酸酯类化合物。告达亭的HBsAg及DNA复制的IC50分别为142.67、40.62 μmol·L-1，在所合成的45个化合物中，TMCA-告达亭酯(C02)的抗HBV活性最强。化合物C02对于HepG2 2.2.15细胞株的CC50为1 821.75 μmol·L-1，对HBsAg及HBeAg的IC50均为5.52 μmol·L-1、SI为330；
对乙肝DNA复制的IC50为2.44 μmol·L-1、SI为746.6，其选择性指数远高于阳性药替诺福韦(Tenofovir)。进一步研究表明，该化合物通过干扰HBV基因表达而非DNA聚合酶发挥抗病毒作用，此特点与先前的抗乙肝病毒药物不同。毒性实验表明，该化合物在小鼠体内无明显致死毒性(>1 250 mg·kg-1)。
CHEN H等[21]对穿心莲内脂进行了结构修饰，测定了其衍生物的抗HBV活性并讨论了构效关系。化合物C03表现出一定的抗HBV活性，其对于HepG2 2.2.15细胞株的CC50为211 μmol·L-1，对HBsAg的IC50为753 μmol·L-1；
对HBeAg的IC50为518 μmol·L-1、SI为330；
对乙肝DNA复制的IC50为53.1 μmol·L-1。
ZHAO Y等[22]以从茵陈蒿(Artemisiacapillaries)中提取的对羟基苯乙酮葡萄糖苷作为先导化合物合成出一系列酯类衍生物，并测定了其抗HBV的活性。其中化合物C04表现出一定抗HBV活性，其对于HepG2 2.2.15细胞株的CC50为925.2 μmol·L-1，对乙肝DNA复制的IC50为5.8 μmol·L-1，SI为160.3，其对DNA复制抑制活性是所有衍生物中最强的。
KONNO H等[23]根据多肽类先导化合物合成出一系列酯类衍生物，并测定其抗非典病毒突变蛋白酶活性(SARS CoV 3CL R188I mutant protease)。其中化合物C05表现出一定的抗该病毒活性，其IC50为250 μmol·L-1，衍生物中活性最强的化合物IC50为43 μmol·L-1。在后续工作[24]中，该组又陆续合成了多种多肽衍生物，其中TMCA酰胺类化合物SK69表现出了显著抗非典病毒突变蛋白酶活性，其IC50为65 μmol·L-1，在所有衍生物中位列第2；
而该化合物还表现出抑制组织蛋白酶B(Cathepsin B)的活性，其IC50为500 μmol·L-1；
在200 μmol·L-1剂量下，该化合物对于Hela细胞未表现出细胞毒性。
QURAT-UL-AIN S等[25]采用DCC/DMAP作为偶联试剂合成了类似鞣质结构的单糖五酯，并测定其抗流感病毒A活性。化合物C06表现出了最佳的抗流感病毒活性，其α/β=63/37、α/β=80/20与α/β=20/80 3种构型对流感病毒A的IC50分别为66.5、66.3、79.2 μmol·L-1。
2.3 神经系统活性
神经系统的药物研发面临着巨大的困难，由于发病机制不明造成其投入大而回报低，TMCA合成酯类化合物后增加了其亲脂性，从而更易于透过血脑屏障，为寻找新的活性神经系统化合物提供了借鉴。JUNG J C等[26]设计合成了一系列TMCA衍生物，采用硫酸催化、常温反应得到了酯类化合物。在抗麻醉活性测试中，化合物D01(见图7)与吗啡联用具有较好的抑制纳洛酮诱导的小鼠跳台行为。而通过对受体抑制活性的测定，发现化合物D01对5-羟色胺受体1A(5-HT1A)具有较好的抑制活性，其IC50为1.1 μmol·L-1。进一步研究表明，该化合物可以提升内质网应激(pERK)水平。表明化合物D01可能通过抑制5-HT1A改善小鼠的神经紊乱并发挥抗麻醉活性。
YANG L X等[27]根据胡椒属植物中分离得到的一种木质素类化合物sintenin，合成了一系列肉桂酸酯衍生物，并测定了其抗脂质过氧化及神经保护活性。化合物D02表现出一定的抗氧化活性，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法(50 μg·mL-1)测定其抑制率为18.6%，高于阳性药槲皮素(11.9%)。其亚铁离子螯合能力(110 μg·mL-1)为2.4%。该化合物的抗氧化能力相较于裸露羟基的阿魏酸咖啡酸衍生物明显偏弱。
ZHANG C等[28]设计合成出一系列他克林酯类衍生物并对其抗老年痴呆活性进行了评估，其中化合物D03表现出一定的抗痴呆活性。其乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, Ache)及丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase, BuChe)的IC50分别为16.88、298.9 nmol·L-1，其对于AChe及BuChe的亲和力比率为17.9，对Aβ(1～42)聚合的抑制浓度为45.88 nmol·L-1。
郑晓晖课题组经过前期代谢研究，在“组合中药分子化学”策略指导下，将TMCA与石菖蒲中α-细辛醚的活性代谢产物α-细辛醇进行拼合[29]，得到TMCA-α-细辛醇酯(D04)，后续合成了一系列α-细辛醇酯衍生物并对其抗癫痫活性进行了系统评价，发现D04在包括最大电休克(maximal electroshock, MES)、戊四唑(pentylenetetrazol, PTZ)、3-巯基丙酸(3-mercaptopropionic acid, 3-MP)在内的多种体内模型中具有抗癫痫活性。在此基础上，笔者将TMCA与天麻中活性单体乙酰天麻素、天麻苷元及香兰醇等进行拼合，得到以TMCA-乙酰天麻酯(D05)及TMCA香兰酯(D06)为代表的化合物同样在多个模型下表现出抗癫痫活性，其中化合物D06能够对潜在靶标GABA转氨酶产生较强作用(见图8)，该研究采用药物设计对中药药对中的活性成分进行研究，是中医配伍理论在新药研发中的再一次升华。
图7 具有神经系统活性的TMCA酯类衍生物
2.4 其他活性
除上述活性外，TMCA酯类化合物还被报道具有抗菌、血管保护、抗炎及抗疟等活性。
ZHENG M等[30]合成了一系列木霉素肉桂酸酯类衍生物并测定了其抗菌活性。化合物E01(见图9)对菌株稻曲病菌(Ustilaginoideaoryzae)及稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)表现出了一定的抑制活性，其EC50分别为11.04、11.70 mg·L-1，抗菌活性最好的化合物为2-F代肉桂酸木霉素酯，其EC50分别为0.56、0.53 mg·L-1。
KU S K等[31]通过在咔唑3位芳香碳上通过溴代、成醚、溴化硼脱甲基反应得到酚羟基后酯化合成了咔唑类TMCA酯并对其进行了血管屏障保护活性评估。化合物E02相较于同时测定的肉桂酰胺类衍生物表现出了更好的活性，在10 μmol·L-1剂量下，其在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和高迁移率族蛋白1(HMGB1)介导的细胞渗透性的抑制率为70.2%，小鼠模型中抑制率为58.9%，其抑制中性粒细胞游走的抑制率为65.4%，小鼠模型中抑制白细胞游走的抑制率为61.2%。
图8 远志-天麻成分衍生物“TMCA香兰酯”与GABA转氨酶的分子模拟对接
图9 具有其他活性的TMCA酯类衍生物
KUMAR S等[32]从胡椒属植物荜茇(Piperlongum)中分离得到了包括TMCA乙酯(e3)在内的多种肉桂酸类化合物，并在后续工作中设计合成[33]了一系列TMCA酯类衍生物，并测定了其抑制白细胞介导的炎症响应活性。通过硫酸催化TMCA与醇成酯后再与P2S5反应可得到羰基硫化的衍生物。化合物E03及其硫代酯E04表现出了最佳的抑制活性。在内皮细胞中，在50 μg·mL-1剂量下，E03对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)所致的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达抑制率可达90%，其IC50为25 μg·mL-1；
20 μg·mL-1剂量下，E04的ICAM-1表达抑制率为95%，IC50为10 μg·mL-1。此外20 μg·mL-1的E03还可以降低血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)及E-选择素抗原的表达(E-selectin)。构效关系显示，烷基酯化的键长及硫化取代均对活性产生了重要影响。
目前有多篇文献报道了TMCA酯类衍生物的抗疟疾活性。PEREIRA G A N等[34]合成了一系列新木质素类衍生物并测定了其抗疟活性。其中化合物E05表现出一定抗疟活性，其对于氚标记的次黄嘌呤(3H-hypoxantine)及富组蛋白(HRPII)的IC50均为127.9 μmol·L-1。
ARATIKATLA E K等[35]对具有抗疟活性的花椒属植物Zanthoxylumsyncarpum中分离出的酰胺化合物syncarpamide进行结构修饰，合成了一系列衍生物。其中化合物E06的抗疟活性是所有化合物中最强的，体外实验中其对于2种恶性疟原虫3D7型及K1型恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)的IC50分别为1.89、1.93 μmol·L-1，高于先导化合物的3.90、2.56 μmol·L-1；
而该化合物在小鼠模型中未能表现出抗疟活性。
DAI Y等[36]对南非火炬花属药用植物Kniphofiaensifolia中分离的具有抗疟活性的蒽醌类先导化合物kniphofiones A与kniphofiones B进行结构修饰，设计合成了一系列衍生物并测定了其抗疟活性。化合物E07具有较好的抗疟活性，对Dd2型疟原虫P.falciparum的IC50为2.7 μmol·L-1；
与其结构相近的3,4-二甲氧肉桂酸-芦荟大黄素酯的抗疟活性最强，IC50为1.3 μmol·L-1，活性分别为先导化合物kniphofiones A与kniphofiones B的7、20倍。
此外，包含TMCA酯结构的异戊醇三甲氧基肉桂酸酯三硅氧烷(isopentyl trimethoxycinnamate trisiloxane)还被欧盟批准作为一种防晒剂进行使用。
在《“十四五”中医药发展规划》颁布的时代背景下，中医药发展迎来了新的机遇，而基于中药成分的结构修饰已经成为中药新药诞生的重要来源[37-38]。课题组在对中药远志活性成分TMCA多年研究的基础上，本研究对TMCA酯类化合物的衍生物活性进行梳理[39]。TMCA酯类化合物经过结构修饰后被作为具有潜在生物活性的基团广泛用于各类先导化合物的开发中，文献报道该类化合物具有抗肿瘤、抗病毒及神经系统等活性。本文对已发表文献中的TMCA酯类衍生物的结构及其生物活性进行总结，期望为该类化合物的进一步开发提供依据。
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