许沁宇 刘帛屿 喻杨乐夫 王军 王成辉
(农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，水产科学国家级实验教学示范中心，上海水产养殖工程技术研究中心，上海海洋大学，上海 201306)
体色是一个重要的生物学性状，在动物的伪装、生存、求偶、繁衍、生殖等生命活动中起着重要的作用[1]。鱼类体色是最为丰富的表型性状和重要的种质特征之一，是研究性状遗传规律和决定基础的良好材料[2]。瓯江彩鲤(Cyprinuscarpiovar.color)是一种主要分布于浙江省瓯江流域的兼具食用和观赏价值的鱼类[3]，因具有体色丰富、肉质鲜嫩等特点而被推广至全国多地养殖。上海海洋大学自1999年开展瓯江彩鲤的种质研究和人工选育以来，已获得5种不同的体色纯合度较高的选育群体，为研究体色遗传基础和机制提供了丰富的素材。
清道夫受体(scavenger receptor，SR)是一种细胞表面糖蛋白，具有广泛的配体识别谱[4-6]，因其可以与多种配体结合，并参与机体的免疫系统，故而被命名为清道夫受体。其中，B族I型清道夫受体(SR-BI/Scarb1)是第1个在分子水平上得到证实的高密度脂蛋白(HDL)受体，参与并介导胆固醇的逆向转运，并在动物体中发挥多种重要的生理作用[7]。Du等[8]研究发现，Scarb1基因在瓯江彩鲤红色体色的形成过程中起着重要的调控作用，在敲除全红体色瓯江彩鲤的Scarb1基因后，发现嵌合体(F0)呈现出体表红色皮肤断裂、红色区域大范围褪色成白色的现象，且白色皮肤组织的类胡萝卜素含量显著降低。可见，Scarb1基因是通过介导类胡萝卜素的含量来影响鱼类体色表型的。
近几年，本实验室应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对瓯江彩鲤的多个体色相关基因进行了敲除，并在敲除基因的F0个体中发现了大量的体色变异个体[9-12]。由于瓯江彩鲤的性成熟时间较长，目前尚未对这些敲除体自交子代的体色表型变化开展研究。本研究以敲除Scarb1基因的瓯江彩鲤敲除体自交繁育获得的F1样本为对象，观察和比较基因敲除型和野生型全红和粉玉体色个体的体表色素细胞形态和体内类胡萝卜素含量变化，以期了解基因敲除体在自交繁育过程中的体色遗传和变异情况，为研究鱼类的体色遗传基础和机制提供资料。
1.1 试验材料
2018年，在上海海洋大学水产动物种质试验站(上海市浦东新区新场镇)，取瓯江彩鲤“龙申1号”的“全红”选育系个体，应用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Scarb1基因，获得了敲除型F0。2020年对敲除型F0进行自繁，获得敲除型F1。本研究选用的试验鱼为敲除型F1的2龄全红和粉玉个体，相应的对照组(野生型)为瓯江彩鲤“龙申1号”F10的2龄全红和粉玉个体。每组试验鱼2种体色各3尾，体质量为200～250 g。
1.2 试验方法
1.2.1 鳞片色素细胞观察
将试验鱼体表的黏液擦除干净后，用干净镊子于鱼体背鳍之下、侧线鳞之上的中间位置取鳞片3～5片，置于磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中暂存。观察时，按照鱼鳞正常生长朝向，将其置于经无水乙醇消毒过的载玻片上，用光学显微镜观察色素细胞的分布和形态，并用成像系统拍照。然后，参照冯彩等[13]的试验方法，用小刀轻轻刮去鳞片表层膜，观察鳞片上色素细胞的层次分布。
1.2.2 体内类胡萝卜素含量测定
采用酶联免疫反应(ELISA)测定试验鱼体内的类胡萝卜素含量。分别取各试验鱼侧线鳞以上的皮肤和肌肉，以及肠道、鳍条、眼睛及血液等组织，加入适量的PBS溶液进行匀浆后，以4 000 r/min的速度离心15 min，取上清液作为检测样品。分别准备空白孔、标准孔、待测样品孔，将类胡萝卜素标准品和待测样品分别进行5倍梯度稀释，加入包被酶标板，封板37 ℃温育30 min。温育结束后，弃上清液,加入洗涤液洗涤5次并晾干，再加入酶标试剂50 μL，于37 ℃下反应30 min。再加入显色液，于37 ℃条件下显色反应10 min后加入终止液，在15 min内测定450 nm波长下的吸光度(OD值)，然后计算出各组织中的类胡萝卜素含量。
2.1 鳞片色素细胞观察
在光学显微镜下，野生型全红个体(W-WR)鳞片上存在大量的黄色素细胞和少量红色素细胞。其中黄色素细胞均匀分布，在10倍镜下单个视野观察到的细胞数为56～66个，直径在30 μm左右，细胞边缘呈树突状，多个细胞的树突状结构连接在一起呈网络状分布。红色素细胞呈团状，直径在40 μm左右，但数量稀少，呈离散型分布在鳞片上。敲除型F1全红个体(M-WR)鳞片上黄色素细胞的分布位置、密集程度和形态大小与野生型相似，单个视野内的细胞数为59～71个，但黄色素细胞的颜色较野生型浅，且未观察到红色素细胞(见图1)。
注：图中Ery为红色素细胞，Xan为黄色素细胞。图1 野生型和敲除型全红体色瓯江彩鲤鳞片上的色素细胞(10倍镜)
进一步观察发现，野生型全红体色的瓯江彩鲤，鳞片上的黄色素细胞内含有明显的细胞核和大量直径1～2 μm的黄色素小泡，色素小泡聚集在细胞主体部分，呈深黄色；
红色素细胞则由许多红色的色素小泡聚集而成，色素小泡直径也是1～2 μm，呈团状分布，但没有观察到细胞核。敲除型全红体色瓯江彩鲤，其鳞片上黄色素细胞中的色素小泡在整个细胞中分布较均匀，色素小泡的直径与野生型的相似，但其分布较野生型稀疏，整体呈现浅黄色(见图2)。
注：图中Ery为红色素细胞，Xan为黄色素细胞；
Iri为虹彩细胞。图2 野生型和敲除型全红体色瓯江彩鲤鳞片上的色素细胞(100倍镜)
在野生型粉玉个体(W-WW)和敲除型粉玉个体(M-WW)鳞片上均仅观察到密集排列、呈短棒状的虹彩细胞，其长度为10 μm左右，在自然光下反射出蓝紫色的光泽。野生型和敲除型虹彩细胞的形态和大小无明显差异(见图3)。
注：
图中Iri为虹彩细胞。图3 野生型和敲除型粉玉体色瓯江彩鲤鳞片上的色素细胞(10倍镜)
2.2 鳞片色素细胞分层观察
根据观察，瓯江彩鲤鳞片的下层(靠近皮肤组织的一侧)均分布着密集排列的虹彩细胞。虹彩细胞中含有反射小板，在自然光下呈现出蓝紫色的光泽。虹彩细胞层之上的色素细胞根据不同的体色而有所不同。野生型全红个体鳞片的虹彩细胞层之上含有红色素细胞和黄色素细胞。敲除型全红个体鳞片的虹彩细胞层之上有均匀分布的黄色素细胞，而未见红色素细胞。敲除型和野生型粉玉个体的鳞片上均只有虹彩细胞，未见黄色素细胞和红色素细胞分布(见表1)。
表1 野生型和敲除型两种体色瓯江彩鲤的鳞片色素细胞分层情况
2.3 类胡萝卜素含量测定
注：数据柱上标有不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。图4 野生型和敲除型两种体色瓯江彩鲤的类胡萝卜素含量变化
野生型和敲除型全红、粉玉体色瓯江彩鲤体内不同组织的类胡萝卜素含量存在一定差异。在肠道和肌肉组织中，野生型全红个体的类胡萝卜素含量显著高于敲除型全红个体(P<0.05)，野生型粉玉个体的类胡萝卜素含量也显著高于敲除型粉玉个体(P<0.05)。在皮肤组织中，野生型全红个体的类胡萝卜素含量显著高于敲除型全红个体(P<0.05)，但野生型粉玉个体的类胡萝卜素含量与敲除型粉玉个体差异不显著(P>0.05)。在鳍条组织中，野生型全红个体的类胡萝卜素含量与敲除型全红个体差异不显著(P>0.05)，而野生型粉玉个体的类胡萝卜素含量显著高于敲除型粉玉个体(P<0.05)。在血浆中，野生型全红个体的类胡萝卜素含量显著高于敲除型全红个体(P<0.05)，但野生型粉玉个体的类胡萝卜素含量与敲除型粉玉个体差异不显著(P>0.05)。在眼睛中，野生型全红和粉玉个体的类胡萝卜素含量与敲除型全红和粉玉个体的差异均不显著(P>0.05)(见图4)。
整体来看，野生型全红个体肠道、血浆、肌肉和皮肤中的类胡萝卜素含量均显著高于敲除型全红个体(P<0.05)；
野生型粉玉个体肠道、肌肉和鳍条组织中的类胡萝卜素含量也显著高于敲除型粉玉个体(P<0.05)。
由于Scarb1基因对于瓯江彩鲤红、白体色的形成有一定影响，因此，野生型和敲除型瓯江彩鲤的体色存在一定的差异。本研究中，在野生型全红个体的鳞片上观察到由红色素小泡聚集而形成的、呈团状离散分布的红色素细胞，以及由黄色素小泡聚集而成的树突状黄色素细胞，且因黄色素小泡较密集而呈现深黄色。敲除型全红个体的鳞片上只有黄色素细胞，且其中色素小泡的分布较野生型的稀疏，黄色素细胞整体呈现出淡黄色。造成这种现象的原因，可能是在Scarb1基因敲除后，瓯江彩鲤对类胡萝卜素的吸收利用效率降低，从而影响了红色素细胞的形成，并且可能对黄色素细胞中黄色素小泡的数量也产生了一定的影响。
有研究发现，microRNA-430b会抑制锦鲤(Cyprinuscarpiokoi)体内Scarb1基因的表达，从而导致锦鲤体表着色受到影响[14-15]。外源性睾丸酮会抑制斑马雀体内类胡萝卜素循环过程，使其红色喙部发生褪色[16]。Toomey等[17]在金丝雀白色突变体的研究中也发现，Scarb1是鸟类类胡萝卜素着色表达的重要基因。以上研究结果均表明，Scarb1基因在多种动物体内影响了类胡萝卜素转运、代谢和沉积等过程。
类胡萝卜素是对鱼类体色着色影响非常大的一类色素，能够在动物体表沉积，从而显示出红、橙、黄等一系列颜色。但是包括鱼类在内的多种生物自身并不能合成类胡萝卜素，只能通过从外界食物中摄取，且经过吸收、转运、转化等一系列过程才能作用于体表着色[18]。本研究发现，肠道和肌肉组织中的类胡萝卜素含量在野生型和敲除型瓯江彩鲤个体之间存在显著差异(P<0.05)。由于类胡萝卜素主要在胃肠道中被生物体吸收和利用[18-19]，因此，敲除Scarb1基因对瓯江彩鲤摄取类胡萝卜素产生了较大影响，导致鱼体摄入的类胡萝卜素总量减少，进而造成肌肉中的色素沉积量也有所降低。本实验室在前期的研究中发现，瓯江彩鲤的皮肤也是类胡萝卜素沉积的重要部位，尤其在全红和粉玉个体的皮肤中，类胡萝卜素含量存在显著差异，这与本研究的结果是一致的。以上研究结果表明，由于Scarb1基因敲除表型向子代遗传，影响了子代对类胡萝卜素等的利用，导致其体色也发生了相应的变化。
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